So sind Neuminsäurederivate nur in pathogenen Bakterien vorhanden, aminiglycosylierte Flagellen enthalten diesen Zucker. Im Rahmen kann die Deletion der in den Genen enthaltenen Region helfen, Flagellenglykosylierungscluster zu finden. Diese Technik, die neueste spezifische Region oder Gene, wie Glykosyltransferasen, die eine hohe Homologie zwischen ihnen haben und an verschiedenen Prozessen beteiligt sind, und analysieren ihre Beteiligung am Flagellenglykosylierungsprozess.
Diese Technik kann auch dazu beitragen, die Rolle von Glykosyltransferasen zu ermitteln, die an der Biosynthese relevanter Polysaccharide in pathogenen Bakterien beteiligt sind, sowie die Rolle von Genen, die für Proteine kodieren, die an der Flagellenbildung beteiligt sind. Maite Polo, eine Technikerin meines Labors, demonstriert das Verfahren. Entwerfen Sie zwei Paare von Primern, die DNA-Regionen vor und hinter dem ausgewählten Gen oder der zu löschenden Region amplifizieren.
Die Primer A und D müssen am Fünf-Prime-Ende eine Restriktionsstelle für eine Endonuklease enthalten, die das Klonen in pDM4 ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass sich die Primer B und C innerhalb des zu löschenden Gens oder innerhalb des ersten und letzten Gens der zu löschenden Region befinden. Stellen Sie sicher, dass sich beide Primer im Rahmen befinden und sich zwischen fünf und sechs Codons innerhalb des Gens befinden.
Stellen Sie sicher, dass beide Primer eine komplementäre Sequenz von 21 Basenpaaren am Fünf-Prime-Ende enthalten, um DNA-Amplikane AB und CD zu verbinden.Verwenden Sie 100 Nanogramm gereinigte chromosomale DNA als Vorlage in zwei Sätzen asymmetrischer PCRs mit AB- und CD-Primern, gefolgt von der Analyse der resultierenden Produkte in 1%Agarosegel. Reinigen und quantifizieren Sie die ausgeschnittenen Amplikone aus elektrophoretischem Gel. Mischen Sie 100 Nanogramm jedes Amplikons mit PCR-Reagenzien ohne Primer.
Nachdem Sie es erweitert haben, fügen Sie A- und D-Primer hinzu und verstärken Sie sie als einzelnes Fragment. Als nächstes analysieren, reinigen und quantifizieren Sie die resultierenden Produkte wie zuvor beschrieben. Verdauen Sie ein Mikrogramm pDM4 und 400 Nanogramm AD-Amplicon mit einer Endonuklease.
Kombinieren Sie das verdaute pDM4 mit AD-Amplicon bei einem molaren Vektor, um ein Verhältnis von eins zu vier einzufügen, und bereiten Sie die Ligationsreaktion vor. Inkubieren Sie über Nacht bei 20 Grad Celsius. Später deaktivieren Sie die T4-Ligase bei 70 Grad Celsius für 20 Minuten.
Escherichia coli Stamm in Luria Bertani Miller Brühe impfen und bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U / min inkubieren, bis eine optische Dichte zwischen 0,4 und 0,6 beobachtet wird. Pelletieren Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 5.000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Suspendieren Sie das Pellet in gekühltem destilliertem Wasser und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang noch zwei weitere Male.
Übertragen Sie die Bakteriensuspension in Mikrofugenröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation bei 14.000 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem Sie das Pellet in gekühltem Wasser wieder suspendiert haben, fügen Sie etwa 3,5 Mikroliter der Ligationsmischung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Überführen Sie den Inhalt in eine gekühlte Elektroporationsküvette mit zwei Millimetern Spalt.
Nach der Elektroporation das SOC-Medium zugeben und den Inhalt in ein Kulturröhrchen überführen. Eine Stunde bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren. Platte die transformierten Zellen auf LB-Agarplatten ergänzt mit Chloramphenicol.
Überprüfen Sie das Einfügen des Löschkonstrukts in pDM4 durch PCR mit Primern, die die pDM4-Klonierungsseite flankieren. Bereiten Sie über Nacht Kulturen vor, damit der Empfänger Aeromonas Rifampicin resistent und zwei verschiedene Stämme von Escherichia coli ist. Der Spenderstamm mit dem rekombinanten Plasmid pDM4 und der Helferstamm mit dem Plasmid PRK 2073 bei 30 Grad Celsius.
Suspendieren Sie die gleiche Anzahl von Kolonien der Spender-, Empfänger- und Helferstämme in drei LB-Röhren mit 150 Mikrolitern LB. Dann mischen Sie auf einer LB-Agarplatte ohne Antibiotika die drei bakteriellen Suspensionen in zwei Tropfen bei einem Verhältnis von Empfänger zu Helfer zu Spender von fünf zu eins zu eins und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius nach oben. Ernten Sie Bakterien, indem Sie einen Milliliter LB-Brühe in die LB-Agarplatte geben. Die bakterielle Suspension in ein konisches 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und einen kräftigen Wirbel überführen.
100 Mikroliter der Bakteriensuspension auf LB-Agarplatten mit Rifampicin und Chloramphenicol verteilen. Drehen Sie 200 Mikroliter und 600 Mikroliter der Proben aus, suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern LB-Brühe und Platte auf LB-Agar mit Rifampicin und Chloramphenicol, gefolgt von Inkubation. Führen Sie einen Oxidase-Test durch, um zu bestätigen, dass es sich bei den Kolonien um Aeromonas handelt.
Weiterhin wird die Insertion von pDM4-rekombinantem Plasmid in die spezifische chromosomale Region durch PCR unter Verwendung der E- und F-Primer bestätigt. Züchten Sie die rekombinanten Kolonien in zwei Millilitern LB mit 10% Saccharose und ohne Antibiotika über Nacht bei 30 Grad Celsius. Nach der Herstellung verschiedener Kulturverdünnungen werden 100 Mikroliter der Bakterienkulturen und Verdünnungen auf LB-Agarplatte mit 10% Saccharose beschichtet und über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert.
Am nächsten Tag holen Sie die Kolonien ab und übertragen sie auf LB-Platten mit und ohne Chloramphenicol. Nachdem Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, wählen Sie die Chloramphenicol-empfindlichen Kolonien aus. Analysieren Sie die empfindlichen Kolonien mittels PCR mit dem EF-Primer-Paar und wählen Sie die Kolonien aus, deren PCR-Produkt mit der Größe des gelöschten Konstrukts korreliert.
Legen Sie einen kleinen Tropfen Silikon in die vier Ecken der Abdeckfolie und montieren Sie die über Nacht gewachsene Kultur von Aeromonas auf einer Abdeckfolie. Legen Sie eine ausgegrabene Rutsche auf die Abdeckrutsche und drehen Sie die Rutsche auf den Kopf. Analysieren Sie die Schwimmmotilität durch Lichtmikroskopie mit einem optischen Mikroskop und übertragen Sie dann drei Mikroliter der Kultur auf die Mitte einer weichen Agarplatte.
Brüten Sie die Platte über Nacht zwischen 25 und 30 Grad Celsius aus. Messen Sie mit einem Lineal am Ende der Inkubation die bakterielle Migration vom Plattenzentrum zur Peripherie durch den Agar. Culture Aeromonas belastet über Nacht in 900 Milliliter TSB zwischen 25 und 30 Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation suspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter 100 millimolar Tris-Chlorwasserstoffpuffer mit einem pH-Wert von 7,8. Um die verankerte Flagelle zu entfernen, steilen Sie die Aufhängung in einem Wirbel mit einer Glasstange für drei bis vier Minuten aus und gehen Sie dann wiederholt durch eine 21-Gauge-Spritze. Pelletieren Sie die Bakterien durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in einem separaten Röhrchen.
Nach dem Ultrazentrifugieren des Überstands suspendieren Sie das Pellet in 150 Mikrolitern 100 millimolärem Tris-Chlorwasserstoff, das zwei millimolare EDTA-Puffer enthält. Übertragen Sie 150 Mikroliter der angereicherten Fraktion der Flagellen auf ein dünnwandiges ultraklares Rohr und füllen Sie es mit 12 Millilitern Cäsiumchloridlösung. Ultrazentrifugieren Sie das Rohr bei 60.000 mal G für 48 Stunden bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimerrotor.
Sammeln Sie das Flagellenband mit einer Spritze in den Cäsiumchloridgradienten und dialysieren Sie gegen 100 Millimolar Tris-Chlorwasserstoff plus zwei millimolare EDTA, gefolgt von einer Analyse durch Elektrophorese und Coomassie-Blaufärbung oder Massenspektrometrie. In der folgenden Abbildung ist Bahn WT Aeromonas piscicola AH3. Die Bahnen eins bis acht zeigen Chloramphenicol-empfindliche Kolonien der zweiten Rekombination.
ST ist Hyperblase 1KB Marker. Die Bahnen eins bis drei und fünf bis acht zeigen die Kolonien mit dem Wildtyp-FGI4-Gen als Lane WT. Spur vier zeigt eine Kolonie mit dem gelöschten FGI4-Gen. Lichtmikroskopische Assays zeigten, dass polare oder laterale Flagellenmodifikationen nur zu einer Verringerung der Migrationsdurchmesser führen, so dass AH-3 FGI-Mutanten und AH-3 FGI-4-Mutanten nur eine reduzierte Motilität in Bezug auf den Wildtypstamm zeigen.
Die Abbildung zeigt das polare Flagellum von AH-3 der ersten Spur und die No-Mutanten in der FGI-Region der zweiten und das FGI-4-Gen der dritten Spur, wobei beide Mutanten polare Flagellaline mit niedrigerem Molekulargewicht als der Wildtypstamm aufweisen, was auf Veränderungen im Flagellenglykan hindeutet. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Mutationen keine nachgeschalteten Gene beeinflussen und die Unfähigkeit zur Flagellenanordnung oder die Unfähigkeit von Filamenten von Flagellen führen. Wenn Veränderungen in Flagellinproteinen nicht nachweisbar sind, ist eine massenspektrometrische Analyse unter Verwendung des Gesamtproteins von Flagellinpeptiden erforderlich, um die Glykanmasse zu kennen.
