Assim, a derivada de ácido neurminico só está presente em bactérias patogênicas, flagela aminiglycosylated contêm este açúcar. Na exclusão de quadros da região contida nos genes pode ajudar a encontrar aglomerados de glicossylação flagella. Essa técnica, a mais recente região específica ou genes, como glicosyltransferases que têm alta homologia entre eles e estão envolvidos em diferentes processos, e analisam seu envolvimento no processo de glicosylation flagella.
Essa técnica também pode ajudar a encontrar o papel das glicosyltransferases envolvidas na biossíntese de polissacarídeos relevantes em bactérias patogênicas e também o papel das proteínas de codificação genética envolvidas na formação de flagela. Demonstrando o procedimento será Maite Polo, uma técnica do meu laboratório. Projete dois pares de primers que amplificam regiões de DNA rio acima e rio abaixo do gene ou região selecionado a ser excluído.
Os primers A e D precisam incluir na extremidade cinco prime, um local de restrição para uma endonuclease que permite a clonagem em pDM4. Certifique-se de que os primers B e C estão dentro do gene a ser excluído ou dentro do primeiro e último gene da região a ser excluído. Certifique-se de que ambos os primers estão em quadro e localizados entre cinco a seis códons dentro do gene.
Certifique-se de que ambos os primers incluam uma sequência complementar de 21 pares de base na extremidade principal cinco para juntar amplificadores de DNA AB e CD.Use 100 nanogramas de DNA cromossômico purificado como modelo em dois conjuntos de PCRs assimétricos com primers AB e CD seguidos pela análise de produtos resultantes em 1%aga gelrose. Purificar e quantificar os amplicons excisados do gel eletroforético. Misture 100 nanogramas de cada amplicon com reagentes PCR sem primer.
Depois de prorrogá-lo, adicione primers A e D e amplie-os como um único fragmento. Em seguida, analisar, purificar e quantificar os produtos resultantes como descrito anteriormente. Digerir um micrograma de pDM4 e 400 nanogramas de amplicon AD com uma endonuclease.
Combine o pDM4 digerido com amplicon AD em um vetor molar para inserir razão de um a quatro e preparar a reação de ligadura. Incubar durante a noite a 20 graus Celsius. Mais tarde, inativar a liga ligase T4 a 70 graus Celsius por 20 minutos.
Inoculada escherichia coli em caldo de Luria Bertani Miller e incubar a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM até que uma densidade óptica entre 0,4 e 0,6 seja observada. Pelota a cultura bacteriana por centrifugação a 5.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Suspenda a pelota em água destilada resfriada e repita o processo de limpeza mais duas vezes.
Transfira a suspensão da bactéria para tubos de microfuge e repita a centrifugação a 14.000 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de reutilizar a pelota em água gelada, adicione aproximadamente 3,5 microliters da mistura de ligadura e incubar no gelo por cinco minutos. Transfira o conteúdo para uma cuvette de eletroporação de dois milímetros refrigerado.
Após a eletroporação adicione o meio SOC e transfira o conteúdo para um tubo de cultura. Incubar por uma hora a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Emplaque as células transformadas em placas de ágar LB suplementadas com clorofenicol.
Verifique a inserção da construção de exclusão em pDM4 pelo PCR usando primers que flanqueiam o lado da clonagem pDM4. Prepare culturas durante a noite para que o receptor Aeromonas cofra resistente à rifampicina e duas cepas diferentes de Escherichia coli. A cepa do doador com o plasmídeo recombinante pDM4, e a cepa auxiliar com o plasmídeo PRK 2073 a 30 graus Celsius.
Suspender o mesmo número de colônias de cepas de doadores, receptores e ajudantes em três tubos LB com 150 microliters de LB. Em seguida, em uma placa de ágar LB sem antibióticos misture as três suspensões bacterianas em duas gotas em um receptor para ajudar a proporção de doadores de cinco para um para um, e incubar a placa de frente durante a noite a 30 graus Celsius. Colher bactérias adicionando um mililitro de caldo LB à placa de ágar LB. Transfira a suspensão bacteriana para um tubo de microfuça cônico de 1,5 mililitro e vigorosamente vórtice.
Espalhe 100 microliters da suspensão bacteriana em placas de ágar LB com rifampicina e clororamfenicol. Gire 200 microliters e 600 microliters das amostras, suspenda a pelota em 100 microliters de caldo LB e placa no ágar LB com rifampicina e clororamfenicol seguido de incubação. Realize um teste oxidase para confirmar que as colônias são Aeromonas.
Confirme ainda a inserção do plasmídeo recombinante pDM4 na região cromossômica específica pelo PCR usando os primers E e F. Cresça as colônias recombinantes em dois mililitros de LB com 10% de sacarose e sem antibióticos durante a noite a 30 graus Celsius. Depois de preparar diferentes diluições culturais, placa 100 microlitres das culturas bacterianas e diluições na placa de ágar LB com 10% de sacarose e incubar durante a noite a 30 graus Celsius.
No dia seguinte, pegue as colônias e transfira-as para placas LB com e sem clororamfenicol. Depois de incuba-los durante a noite a 30 graus Celsius, selecione as colônias sensíveis ao cloroamfenicol. Analise as colônias sensíveis por PCR usando o par de primers EF e selecione as colônias cujo produto PCR está correlacionado com o tamanho da construção excluída.
Coloque uma pequena gota de silicone nos quatro cantos do slide da tampa e monte a cultura cultivada durante a noite de Aeromonas em um slide de cobertura. Coloque um slide escavado no slide da tampa e vire o slide de cabeça para baixo. Analise a motilidade da natação por microscopia leve usando um microscópio óptico, em seguida, transfira três microlitros da cultura para o centro de uma placa de ágar macia.
Incubar a placa de frente para cima durante a noite entre 25 e 30 graus Celsius. Usando uma régua no final da incubação, meça a migração bacteriana do centro da placa em direção à periferia através do ágar. Cultura Aeromonas se esforça durante a noite em 900 mililitros TSB entre 25 e 30 graus Celsius.
Após a centrifugação, suspenda a pelota em 20 mililitros de 100 mililitros tris tampão de cloreto de hidrogênio de pH 7.8. Para remover a flagela ancorada, ria a suspensão em um vórtice com uma barra de vidro por três a quatro minutos, e depois passe repetidamente por uma seringa calibre 21. Pellule a bactéria por duas centrífugas consecutivas a quatro graus Celsius e colete o sobrenatante em um tubo separado.
Depois de ultracentrifugar o supernascer, suspenda a pelota em 150 microliters de 100 mililitros de hidrogênio Tris contendo dois amortecedores EDTA milimolares. Transfira 150 microliters da fração enriquecida de flagela para um tubo ultra claro murado fino, e encha-o com 12 mililitros de solução de cloreto de césio. Ultracentrificar o tubo a 60.000 vezes G por 48 horas a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando.
Colete a banda flagela no gradiente de cloreto de césio com uma seringa e dialyze contra cloreto de hidrogênio Tris de 100 milimolar mais dois milimolares EDTA seguido de análise por eletroforese e coloração azul Coomassie ou espectrometria de massa. Na figura a seguir, a pista WT é Aeromonas piscicola AH3. As pistas de um a oito mostram colônias sensíveis ao clorofínico da segunda recombinação.
ST é marcador de 1KB de hiper bexiga. As pistas de um a três e cinco a oito mostram as colônias com o gene FGI4 tipo selvagem como pista WT. Lane quatro mostra uma colônia com o gene FGI4 excluído. Os ensaios de microscopia leve mostraram que modificações polares ou laterais de flagela só levam a reduções nos diâmetros de migração, assim, os mutantes AH-3 FGI e AH-3 FGI-4 mostram apenas a redução da motilidade em relação à cepa do tipo selvagem.
A figura mostra flagelo polar de AH-3 da pista um, e os não mutantes na região FGI da pista dois e gene FGI-4 da pista três, onde ambos os mutantes têm flagellins polares com menor peso molecular do que a cepa tipo selvagem, o que sugere alterações naflaella glycan. É importante garantir que as mutações não afetem genes a jusante e levem a incapacidade para o conjunto flagella ou a incapacidade de filamentos de flagela. Quando a mudança nas proteínas flagellin não são detectáveis, a análise de espectrometria de massa é necessária usando a proteína total de peptídeos flagellin para conhecer a massa glican.
