Por lo tanto, los derivados del ácido neumínico solo están presentes en bacterias patógenas, los flagelos aminiglicosilados contienen este azúcar. En el marco, la deleción de la región contenida en los genes puede ayudar a encontrar grupos de glicosilación de flagelos. Esta técnica, la última región o genes específicos, como las glicosiltransferasas que tienen una alta homología entre ellas y están implicadas en diferentes procesos, y analizan su implicación en el proceso de glicosilación de flagelos.
Esta técnica también puede ayudar a encontrar el papel de las glicosiltransferasas involucradas en la biosíntesis de polisacáridos relevantes en bacterias patógenas y también el papel de las proteínas codificantes de genes involucradas en la formación de flagelos. Demostrando el procedimiento estará Maite Polo, técnica de mi laboratorio. Diseñe dos pares de cebadores que amplifiquen las regiones de ADN aguas arriba y aguas abajo del gen o región seleccionada que se eliminará.
Los cebadores A y D deben incluir en los cinco extremos primos, un sitio de restricción para una endonucleasa que permita la clonación en pDM4. Asegúrese de que los cebadores B y C estén dentro del gen que se va a eliminar o dentro del primer y último gen de la región que se va a eliminar. Asegúrese de que ambos cebadores estén en el marco y ubicados entre cinco y seis codones dentro del gen.
Asegúrese de que ambos cebadores incluyan una secuencia complementaria de 21 pares de bases en los cinco extremos principales para unir los amplicones de ADN AB y CD.Utilice 100 nanogramos de ADN cromosómico purificado como plantilla en dos conjuntos de PCR asimétricas con cebadores AB y CD seguidos del análisis de los productos resultantes en gel de agarosa al 1%. Purificar y cuantificar los amplicones extirpados del gel electroforético. Mezclar 100 nanogramos de cada amplicón con reactivos de PCR sin imprimación.
Después de extenderlo, agregue imprimaciones A y D y amplíelas como un solo fragmento. A continuación, analice, purifique y cuantifique los productos resultantes como se describió anteriormente. Digiera un microgramo de pDM4 y 400 nanogramos de amplicón AD con una endonucleasa.
Combine la pDM4 digerida con el amplicóN AD en un vector molar para insertar una proporción de uno a cuatro y preparar la reacción de ligadura. Incubar durante la noche a 20 grados centígrados. Más tarde, inactivar la ligasa T4 a 70 grados centígrados durante 20 minutos.
Inocular la cepa de Escherichia coli en caldo Luria Bertani Miller e incubar a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM hasta observar una densidad óptica entre 0,4 y 0,6. Pellet el cultivo de bacterias por centrifugación a 5.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Suspenda el pellet en agua destilada refrigerada y repita el proceso de limpieza dos veces más.
Transfiera la suspensión de bacterias a tubos de microfugas y repita la centrifugación a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de volver a suspender el pellet en agua fría, agregue aproximadamente 3.5 microlitros de la mezcla de ligadura e incube en hielo durante cinco minutos. Transfiera el contenido a una cubeta de electroporación de dos milímetros refrigerada.
Después de la electroporación, agregue el medio SOC y transfiera el contenido a un tubo de cultivo. Incubar durante una hora a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM. Placa las células transformadas en placas de agar LB suplementadas con cloranfenicol.
Verifique la inserción de la construcción de eliminación en pDM4 mediante PCR utilizando cebadores que flanqueen el lado de clonación de pDM4. Prepare cultivos nocturnos para que el receptor de la cepa Aeromonas sea resistente a la rifampicina y dos cepas diferentes de Escherichia coli. La cepa donante con el plásmido recombinante pDM4 y la cepa auxiliar con el plásmido PRK 2073 a 30 grados centígrados.
Suspender el mismo número de colonias de las cepas donante, receptora y ayudante en tres tubos LB con 150 microlitros de LB. Luego, en una placa de agar LB sin antibióticos, mezcle las tres suspensiones bacterianas en dos gotas en un receptor para ayudar a la proporción de donante de cinco a uno a uno, e incube la placa boca arriba durante la noche a 30 grados centígrados. Cosecha las bacterias agregando un mililitro de caldo LB a la placa de agar LB. Transfiera la suspensión bacteriana a un tubo cónico de microfugio de 1,5 mililitros y vórtice vigoroso.
Extienda 100 microlitros de la suspensión bacteriana en placas de agar LB con rifampicina y cloranfenicol. Haga girar 200 microlitros y 600 microlitros de las muestras, suspenda el pellet en 100 microlitros de caldo LB y plato en agar LB con rifampicina y cloranfenicol seguido de incubación. Realizar una prueba de oxidasa para confirmar que las colonias son Aeromonas.
Confirmar además la inserción de plásmido recombinante pDM4 en la región cromosómica específica mediante PCR utilizando los cebadores E y F. Cultive las colonias recombinantes en dos mililitros de LB con 10% de sacarosa y sin antibióticos durante la noche a 30 grados centígrados. Después de preparar diferentes diluciones de cultivo, placa 100 microlitros de los cultivos bacterianos y diluciones en placa de agar LB con 10% de sacarosa e incubar durante la noche a 30 grados centígrados.
Al día siguiente, recoja las colonias y transfiéralas a placas LB con y sin cloranfenicol. Después de incubarlos durante la noche a 30 grados centígrados, seleccione las colonias sensibles al cloranfenicol. Analice las colonias sensibles por PCR utilizando el par de cebadores EF y seleccione las colonias cuyo producto de PCR se correlacionó con el tamaño de la construcción eliminada.
Coloque una pequeña gota de silicona en las cuatro esquinas del portaobjetos de la cubierta y monte el cultivo cultivado durante la noche de Aeromonas en un portaobjetos de cubierta. Coloque una corredera excavada en la corredera de la cubierta y gire la corredera boca abajo. Analice la motilidad de la natación mediante microscopía de luz utilizando un microscopio óptico, luego transfiera tres microlitros del cultivo al centro de una placa de agar blando.
Incubar la placa boca arriba durante la noche entre 25 y 30 grados centígrados. Usando una regla al final de la incubación, mida la migración bacteriana desde el centro de la placa hacia la periferia a través del agar. Cultivo Aeromonas se cuela durante la noche en 900 mililitros TSB entre 25 y 30 grados centígrados.
Después de la centrifugación, suspenda el pellet en 20 mililitros de tampón de cloruro de hidrógeno Tris milimolar de pH 7.8. Para quitar los flagelos anclados, coloque la suspensión en un vórtice con una barra de vidrio durante tres o cuatro minutos, y luego pase repetidamente a través de una jeringa de calibre 21. Peletizar la bacteria mediante dos centrifugaciones consecutivas a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en un tubo separado.
Después de ultracentrifugar el sobrenadante, suspenda el pellet en 150 microlitros de cloruro de hidrógeno Tris milimolar 100 que contiene dos tampones milimolares de EDTA. Transfiera 150 microlitros de la fracción enriquecida de flagelos a un tubo ultra claro de pared delgada y llénelo con 12 mililitros de solución de cloruro de cesio. Ultracentrifugar el tubo a 60.000 veces G durante 48 horas a cuatro grados centígrados en un rotor de cucharón oscilante.
Recoger la banda de flagelos en el gradiente de cloruro de cesio con una jeringa y dializar contra cloruro de hidrógeno Tris 100 milimolar más dos milimolares EDTA seguido de análisis por electroforesis y tinción azul de Coomassie o espectrometría de masas. En la siguiente figura, el carril WT es Aeromonas piscicola AH3. Los carriles uno a ocho muestran colonias sensibles al cloranfenicol de la segunda recombinación.
ST es un marcador de hiper vejiga de 1KB. Los carriles uno a tres y cinco a ocho muestran las colonias con el gen FGI4 de tipo salvaje como carril WT. El carril cuatro muestra una colonia con el gen FGI4 eliminado. Los ensayos de microscopía de luz mostraron que las modificaciones de flagelos polares o laterales solo conducen a reducciones en los diámetros de migración, por lo tanto, los mutantes AH-3 FGI y AH-3 FGI-4 muestran solo una motilidad reducida en relación con la cepa de tipo salvaje.
La figura muestra el flagelo polar de AH-3 del carril uno, y los no mutantes en la región FGI del carril dos y el gen FGI-4 del carril tres, en el que ambos mutantes tienen flagelinas polares con menor peso molecular que la cepa de tipo salvaje, lo que sugiere alteraciones en los flagelos de glicano. Es importante asegurarse de que las mutaciones no afecten a los genes aguas abajo y conduzcan a la incapacidad del ensamblaje de flagelos o a la incapacidad de filamentos de flagelos. Cuando el cambio en las proteínas de flagelina no es detectable, se requiere un análisis de espectrometría de masas utilizando la proteína total de los péptidos de flagelina para conocer la masa de glicanos.
