Таким образом, используя этот протокол, мы можем визуализировать цитонемы в фиксированной ткани мыши по всему эмбриону с помощью стандартной световой микроскопии. Используя этот метод, мы можем исследовать эндогенные сигнальные белки, которые путешествуют вдоль цитонем, а не полагаться на генетически манипулируемые мышиные модели, которые используют флуоресцентно помеченные белки. При попытке этого протокола важно осторожно обрабатывать участки тканей для оптимального сохранения цитонем.
Продемонстрировать эту процедуру будут Мириам Диллард, ведущий исследователь в моей группе, и Кристина Дейли, аспирантка Сент-Джуда. Для начала используйте рассекающие ножницы и щипцы, чтобы сделать Y-разрез в брюшной полости. Иссечь матку, содержащую эмбрион Е 9,5.
Рассекайте эмбрионы в полной среде роста DMEM. Используйте щипцы для удаления желтка SAC, плаценты и окружающих мембран. Промыть изолированные эмбрионы в HBSS, чтобы удалить любую остаточную амниотическую ткань и кровь.
Затем приготовьте фиксатор, добавив параформальдегид в HBSS для рабочей концентрации 4% параформальдегида. Добавьте по одному миллилитру этого раствора в каждую лунку 24-луночной плиты. Поместите эмбрионы в отдельные лунки.
Высиживайте эмбрионы в течение 45 минут легким перемешиванием на коромысле. После инкубации удалите фиксатор и трижды промойте эмбрионы, в течение 30 минут в PBS с добавлением кальция, магния и 0,1% тритона. Затем инкубируют эмбрионы в блокирующем растворе с мягким перемешиванием дважды, по одному часу каждый.
После второй инкубации промыть эмбрионы свежим блокирующим раствором. Тем временем приготовьте раствор первичного антитела, разбавляя антитела в дополненном PBS. После того, как полоскание будет завершено, удалите блокирующий раствор и добавьте по одному миллилитру раствора первичных антител в каждую лунку.
Инкубируйте пластину при четырех градусах Цельсия с мягким вращением в течение трех дней. После первичной инкубации антител промыть эмбрионы с добавлением PBS пять раз в течение одного часа на коромысле при 20 оборотах в минуту. Затем добавляют по одному миллилитру раствора вторичных антител в каждую лунку.
Высиживать плиту с нежным раскачиванием при четырех градусах Цельсия в темноте в течение трех дней. Удалите раствор вторичных антител и трижды промойте эмбрионы в течение 30 минут в дополненном PBS. Готовят 4% раствор по массе агарозы с низкой температурой плавления в ПБС с кальцием и магнием.
Одновременно поместите 12-луночную пластину в бисеринную ванну с температурой 55 градусов Цельсия и добавьте три миллилитра агарозы в каждую лунку. Затем поместите тарелку на столешницу и перенесите эмбрионы в отдельные лунки с помощью перфорированной ложки. Используйте наконечники пипеток, чтобы аккуратно встроить и сориентировать эмбрион таким образом, чтобы он был центрирован внутри раствора.
Как только эмбрионы будут ориентированы, поместите пластину при минус 20 градусах Цельсия на 10 минут для затвердевания. Затем с помощью скальпеля извлеките из лунки весь блок агарозы. Вырежьте прямоугольный блок вокруг эмбриона, оставив примерно по 0,3 сантиметра блока с каждой стороны.
Оставьте дополнительную длину блока вдоль каудального конца эмбриона. Чтобы закрепить эмбрион на вибратоме, сначала нанесите полоску ленты на держатель образца. Ориентируйте эмбрион в вертикальном положении в верхней части блока и супер приклейте блок агарозы к ленте, так что лезвие будет генерировать осевые участки в передней и задней последовательности.
Затем заполните камеру вибратома холодным HBSS, чтобы полностью погрузить образец, а затем окружите камеру льдом. Задайте параметры на вибратоме и выполните последовательное осевое сечение эмбриона. Используйте щипцы для переноса отдельных секций в отдельную посуду, наполненную HBSS.
Не забывайте использовать щипцы для удержания только агарозы, чтобы избежать повреждения тканей и разрушения цитонем. Чтобы выполнить окрашивание F-актином, удалите HBSS и инкубируйте срезы в течение 40 минут раствором ActinRed и DAPI в дополненном PBS. После инкубации промыть участки трижды в течение 20 минут в дополненном ПБС.
С помощью гидрофобной маркерной ручки нарисуйте барьер по краям слайда заряженного микроскопа и добавьте небольшой объем HBSS в область заполнения. Затем используйте щипцы для переноса секций на слайд. Удалить излишки агарозы с помощью щипцов.
После того, как все секции были перенесены на горку, удалите лишнюю жидкость путем пипетки и использования угла абсорбирующей салфетки. Затем добавьте несколько капель монтажного носителя на слайд. Установите крышку, аккуратно поместив ее на затвор.
Для анализа выполните визуализацию участков ткани как минимум для трех эмбрионов на генотип на конфокальном или любом микроскопе высокого разрешения. Здесь показаны правильно ориентированные разделы, подготовленные с использованием этого протокола. По сравнению с вибратомным сечением, криостатное сечение ткани не сохраняло клеточных расширений.
Несколько GFP-положительных фрагментов мембраны были обнаружены между клетками нотохорды и нервной трубки, а также между соседними клетками нервной трубки в криостатных срезах. Однако окрашивание F-актином клеточных расширений в мезенхимальных клетках, окружающих нервную трубку, было нарушено в криостатных секциях. Сечение вибратома обеспечило минимальное разрушение всего эмбриона и отдельных участков ткани.
Оптимально обработанные участки позволили обнаружить ктионемы между соседними локализованными нейронными эпителиальными клетками пластины пола и мезенхимальными клетками. Сложенные или согнутые секции были очевидны по большому разделению между нотохордной и вентральной пластиной пола нервной трубки. И потеря расширений клеточной мембраны, мигрирующих между эпителиальными клетками.
F-актиновые и DAPI-окрашенные участки имели последовательное расстояние между мезенхимальными клетками и ктионемами, окружающими нервную трубку и нотохорду. Незначительные искажения секций, возможно, вызвали фрагментацию расширений на основе актина и образование больших зазоров между клетками, что подчеркивает необходимость деликатного обращения. После разрезания эмбриона крайне важно свести к минимуму любые изгибы или сворачивание участков ткани.
для предотвращения разрушения цитонем. Используя эту технику, мы можем непосредственно визуализировать, как сигнальные молекулы, такие как морфогены, распространяются по тканям. Это дает нам новое понимание того, как моделируются ткани и органы.
