Эти протоколы позволяют исследователям выйти за рамки простого измерения потребления кислорода митохондриями и вместо этого позволяют измерять ключевые митохондриальные конечные продукты, АТФ и активные формы кислорода. Основное преимущество этого метода заключается в том, что исследователь может измерить эффективность митохондрий, напрямую сравнивая скорость потребления кислорода со скоростью производства конечного продукта. Независимо от того, является ли конечным продуктом АТФ или активный кислород.
Методы требуют очень тщательного внимания к деталям, особенно в предотвращении пузырей. Независимо от того, находятся ли они в дыхательной камере или шприцах для титрования, пузырьки - ваш враг, потому что они делают измерения менее точными. После получения биопсии скелетных мышц.
Наполните камеры респирометра средой, не содержащей магния, и герметизируйте инкубационную камеру. Установите температуру инкубации прибора на 38 градусов по Цельсию, чтобы представить базальную температуру скелетных мышц лошади. И установите перемешивание дыхательной среды на 750 об/мин с помощью магнитного перемешивания, вращающегося в нижней части камеры респирометра.
Далее выключите подсветку камеры, чтобы избежать помех люминесцентным датчикам. Включите кислородный электрод поляризационным напряжением 800 милливольт и усильте полученный сигнал с установкой усиления единицы. Записывайте концентрацию кислорода каждые две секунды и рассчитывайте поток кислорода как отрицательный наклон измерения кислорода в течение последующих 40 секунд.
Затем откалибруйте датчик кислорода, позволив среде уравновеситься с воздухом в помещении. Рассчитайте эталонное парциальное давление кислорода на основе барометрического давления, измеренного респирометром высокого разрешения, и стандартной концентрации кислорода в атмосфере. Используйте зеленые флуоресцентные датчики для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры.
Включите датчики на напряжение от 400 до 500 милливольт, и полученный сигнал усилится с коэффициентом усиления от 1 до 1 000. Затем добавьте TMRM в дыхательную камеру перед добавлением митохондрий и откалибруйте флуоресцентный сигнал, используя простую двухточечную калибровку флуоресцентного сигнала по сравнению с количеством добавленного флуорофора до добавления митохондрий. Выполните окончательную калибровку сигнала TMRM после завершения протокола титрования респирометрии, доставив несколько титров развязывающего агента до тех пор, пока не будет наблюдаться дальнейшее увеличение флуоресцентного сигнала TMRM, что указывает на полный коллапс мембранного потенциала митохондрий.
Используйте синие флуоресцентные датчики для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры и подачи питания на эти датчики для отдельных приборов для захвата ожидаемого сигнала в линейном диапазоне датчика. Добавьте восемь микролитров двухмиллимолярной ЭДТА в дыхательную камеру для хелатирования катионов, которые будут конкурировать с ионами магния за связывание с зеленым магнием. Затем добавьте четыре микролитра одного миллимоля зеленого магния в дыхательную камеру.
Откалибруйте необработанный флуоресцентный сигнал с помощью последовательного титрования 100 миллимоляров хлорида магния размером 10 на 2 микролитра, что позволяет стабилизировать флуоресцентный сигнал в течение одной минуты между титрами. Определите скорость синтеза ATTP, которая представляет собой наклон концентрации АТФ с течением времени по всему протоколу. Используйте зеленые флуоресцентные датчики для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры.
Включите датчики от 300 до 400 милливольт. И результирующий сигнал усиливается с коэффициентом усиления от 1 до 1 000. Оптимизируйте конкретные настройки для отдельных приборов, чтобы улавливать ожидаемый сигнал в линейном диапазоне датчика.
Перед добавлением митохондрий выполните химическую настройку и первоначальную калибровку анализа Amplex UltraRed. Добавьте 30 микромолей DTPA к хелатным катионам, которые могут мешать реакции. Затем добавьте супероксиддисмутазу или пильчатую пероксидазу и Amplex UltraRed в камеру респирометрии.
Дайте флуоресцентному сигналу стабилизироваться. Затем добавьте 0,2 микромоль перекиси водорода дважды с промежутком в пять минут. Выполните дополнительные двухточечные калибровки на протяжении всего анализа, чтобы можно было регулировать чувствительность анализа по мере изменения химического состава респирометрии на протяжении всего анализа с указанием конкретных сроков этих калибровочных точек по усмотрению исследователя.
Встряхните образец, чтобы поддерживать однородную суспензию образца, и добавьте 15 микролитров изолированной суспензии митохондрий в каждую двухмиллилитровую инкубационную камеру, чтобы результаты представляли выход митохондрий в 18,75 миллиграмма мышц. Перед добавлением каких-либо субстратов измерьте остаточное потребление кислорода и вычтите это значение из значений потребления кислорода на каждом этапе титрования несвязанного ингибитора субстрата или протокола SUIT после завершения. Используйте универсальный SUIT, который позволяет получить первоначальную характеристику митохондриальной функции скелетных мышц лошадей.
Начните с последовательного титрования пирувата, глутамата и малата друг в друга в каждой камере для получения никотинамидадениндинуклеотида и стимуляции нефосфорилирующего дыхания, поддерживаемого НАДН, окисленным через сложную утечку на одной основе. Затем добавьте АДФ, чтобы стимулировать фосфорилирующее дыхание посредством сложного фосфорилирующего дыхания. Добавьте сукцинат для получения фосфорилирующего дыхания, комбинируя комплексное ординарное дыхание и комплексное два фосфорилирующего дыхания Добавьте ротенон, чтобы блокировать комплексный.
Результирующий поток кислорода представляет собой способность второго комплекса поддерживать потребление кислорода митохондриями за счет окисления только сукцината. Показан след респирометрии высокого разрешения митохондриального дыхания скелетных мышц лошадей и относительный мембранный потенциал. Значения дыхания митохондрий, инкубированных с TMRM, ниже из-за ингибирующего действия этого фторофора.
Показано митохондриальное дыхание и синтез АТТФ скелетных мышц лошадей, содержащих высокий процент богатых митохондриями волокон скелетных мышц первого типа и инкубированных в условиях, приближенных к метаболизму в состоянии покоя. Показана респирометрия следов митохондриального дыхания скелетных мышц лошадей и продукции перекиси водорода. Респирометрия высокого разрешения требует большого терпения.
У человека, проводящего анализ, будет много моментов времени, в течение которых ему нужно будет принять решение о том, было ли достигнуто устойчивое состояние и может ли произойти следующий шаг. Мы продемонстрировали только один протокол титрования. Существуют десятки других протоколов, которые могут применяться таким же образом для решения конкретных вопросов, касающихся митохондриального метаболизма.
