Целью этого метода является идентификация мутантов в фотодыхающем пути с использованием скрининга с низким содержанием CO2. Мы представляем метод идентификации мутантов, которые нарушают фотодыхание после воздействия низкого уровня CO2. Преимуществом данного метода является то, что это высокопроизводительный скрининг рассады, который можно сделать за относительно короткий промежуток времени.
В следующих разделах будут представлены подробные сведения о подготовке и стерилизации семян, росте растений и обработке с низким содержанием CO2, настройке системы флуоресцентной визуализации, измерении квантового выхода обработанных образцов, репрезентативных результатах и выводах. Подготовка семян и стерилизация. Подготовка семян состоит из впитывания семян и стерилизации семян.
Важно отметить, что все эти шаги выполняются в ламинарной вытяжке для поддержания стерильных условий. Все необходимые материалы, реагенты и питательная среда являются автоклавными. Используются семенные линии plgg1-1, abcb26 и WT или дикого типа.
Впитывайте семена в стерильной воде в ламинарной проточной вытяжке, затем расслаивайте при четырех градусах Цельсия в темноте в течение двух дней. В стерильных условиях подготовьте 10 миллилитров 50% объема к объемному отбеливающему раствору и добавьте приблизительно 20 микролитров Tween 20. Удалите воду из впитанных семян, затем добавьте один миллилитр раствора отбеливателя в микроцентрифужную трубку и высиживайте при комнатной температуре в течение пяти минут.
Удалите раствор отбеливателя пипеткой. Промыть семена в одном миллилитре стерильной воды для повторного суспендирования. Удалите воду, как только семена осядут на дно.
Повторно суспендировать семена в стерильном 0,1% растворе агарозы. Для покрытия семян, базальная среда пластин с 1%MS средой с витаминами и 1% агаром для выращивания тестовых мутантов. Вырежьте лезвием бритвы наконечник пипетки объемом 200 микролитр.
Используя пипетку, поместите одно семя в центр назначенной квадратной сетки для каждого тестового мутанта или генотипа. Здесь используется квадратная пластина с сеткой один на один сантиметр. Это помогает сохранить равномерное расстояние между каждым саженцем и избежать перекрытия, что будет важно позже при флуоресцентной визуализации и анализе.
После того, как семена будут покрыты, оберните хирургическую ленту вокруг крышки, чтобы запечатать, а затем поместите ее в камеру роста. Рост растений и низкая обработка CO2. Выращивайте растения в течение семи-девяти дней при температуре 20 градусов по Цельсию при восьмичасовом световом цикле 120 микромолей на квадратный метр в секунду и 16 часах темноты при 18 градусах Цельсия.
Проверьте растения на шестой день, чтобы определить, достаточно ли они велики для визуализации. На восьмой день после нанесения покрытия подвергайте растения воздействию низкого уровня CO2. Поместите очистные сооружения в герметичный ящик в камере роста с интенсивностью света 200 микромолей на квадратный метр в секунду в течение 12 часов.
Низкое состояние CO2 было построено с использованием герметичного прозрачного контейнера со 100 граммами натриевой извести, помещенной в нижнюю часть контейнера. Контейнер помещали в ту же камеру роста, что и контрольную. Контрольные установки будут оставаться ниже 120 микромолей на квадратный метр в секунду в окружающем CO2 в течение 12 часов.
Настройте систему флуоресцентной визуализации. Поместите испытательную пластину, центрированную под камерой на фиксированном расстоянии в системе флуоресцентной визуализации. В программном обеспечении прибора перейдите к живому окну и установите флажок Вспышки, чтобы включить неактинические измерительные вспышки.
Нажимайте на инструменты масштабирования и фокусировки, пока не увидите полное и четкое изображение. Установите значение затвора EL равным нулю и отрегулируйте чувствительность для получения флуоресцентного сигнала в диапазоне от 200 до 500 цифровых единиц. Поместите измеритель освещенности в то же положение, которое используется для настройки параметров камеры.
В интерактивном окне установите флажок Super, чтобы запустить насыщающий импульс продолжительностью 800 миллисекунд. Используйте ползунок для регулировки процента относительной мощности для суперимпульса до тех пор, пока измеритель освещенности не считывает от 6 000 до 8 000 микромолей на квадратный метр в секунду. Измерьте квантовый выход обработанных образцов.
Непосредственно после обработки покрывают пластины алюминиевой фольгой в течение 15 минут для темной адаптации. Снимают фольгу для измерения квантового выхода фотосистемы два с помощью импульсной амплитуды модифицированного флуорометра. Затем поместите пластину рассады непосредственно под камеру и запустите протокол квантовой урожайности, найденный в нашем репозитории GitHub.
Загрузите протокол квантовой доходности с GitHub. Используйте программное обеспечение флюорометра, чтобы открыть файл программы, щелкнув значок папки и перейдя к расположению файла. Запустите протокол квантового выхода, нажав на значок красной молнии.
После завершения работы с протоколом перейдите в окно предварительного анализа. Разделите пластину на отдельные саженцы, выделив все пиксели для каждого саженца на изображении тарелки. Щелкните Исключение фона, чтобы удалить все выделенные пикселы фона, оставив только область рассада.
Нажмите «Анализировать», чтобы сгенерировать данные флуоресценции для каждого саженца на изображении пластины. Вручную отрегулируйте диапазон значений флуоресценции для отображения последовательных минимальных и максимальных значений среди всех пластин. На вкладке Эксперимент нажмите кнопку Экспорт, затем Числовой.
Нажмите на Числовое среднее, чтобы сгенерировать текстовый файл, содержащий квантовую урожайность для каждого саженца. Откройте текстовый файл и электронную таблицу для анализа. Электронная таблица содержит номер области, размер пикселей, Fm, Ft, Fq и QY. Во-первых, нам нужно определить номер области по соответствующему ему генотипу, будь то дикий тип или тестовый мутант, Результаты.
Вот фотографии пластин необработанных и флуоресцентных изображений из окружающей среды и скрининга с низким содержанием CO2 диких типов и тестовых мутантов. Каждая пластина помечена номером области с соответствующими показаниями флуоресценции как квантовый выход или QY. Данные экспортируются в виде текстового файла и могут быть открыты в электронной таблице для анализа. Темный адаптированный квант Fv / Fm дает эффективность диких типов и мутантов визуализируется участками коробки и усов.
Для проверки статистической разницы диких типов и тестовых мутантов использовался попарный Т-тест со значением P менее 0,05. Здесь мы используем фотодыхающую мутантную линию с уменьшенным квантовым выходом Fv / Fm в качестве тестового мутанта для проверки эффективности нашего метода скрининга. Наши результаты показывают, что тестовые мутанты имеют значительно более низкую эффективность квантового выхода по сравнению с дикими типами.
Это указывает на то, что наш метод скрининга способен идентифицировать фотодыхающих мутантов с использованием скрининга с низким уровнем CO2. Выводы. Важно помнить при использовании этого протокола, чтобы убедиться, что саженцы Arabidopsis достаточно велики для измерения флуоресценции, но не настолько велики, чтобы растения перекрывались во время визуализации. Предпочтительно изображать саженцы как первые настоящие листья, чтобы попытаться сохранить размер листьев и углы листьев равномерными.
Этот протокол может быть использован в качестве высокопроизводительного скрининга для рассады. Визуализация каждой пластины относительно быстрая и имеет потенциал для скрининга более 1000 саженцев в день. Флуоресцентный анализ хлорофилла позволил нам идентифицировать фотодыхающих мутантов с использованием скрининга с низким содержанием CO2, что важно для поддержания эффективности фотодыхания.
Этот протокол не ограничивается Arabidopsis и имеет потенциальное применение для экспериментов по абиотической реакции на стресс.
