该方法的目标是使用低 CO2 筛选来识别光呼吸通路中的突变体。我们提出了一种方法来识别暴露于低 CO2 后破坏光呼吸的突变体。这种方法的一个优点是，它是可以在相对较短的时间内完成的高通量幼苗筛选。
以下部分将提供有关种子制备和灭菌、植物生长和低 CO2 处理、配置荧光成像系统、测量处理样品的量子产率、代表性结果和结论的详细信息。种子制备和灭菌。种子制备包括种子吸收和种子灭菌。
重要的是要注意，所有这些步骤都是在层流罩中完成的，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和生长培养基均经过高压灭菌。使用的种子系是plgg1-1，abcb26和WT或野生型。
将种子浸入层流罩中的无菌水中，然后在黑暗中在四摄氏度下分层两天。在无菌条件下，准备10毫升50%体积的漂白剂溶液，并加入约20微升吐温20。从吸收的种子中取出水分，然后将一毫升漂白剂溶液加入微量离心管中，并在室温下孵育五分钟。
用移液管取出漂白剂溶液。用一毫升无菌水冲洗种子以重悬。种子沉降到底部后取出水。
将种子重悬于无菌0.1%琼脂糖溶液中。对于种子铺板，基础培养基平板含有1%MS培养基和维生素和1%琼脂，用于培养测试突变体。用剃须刀片切割 200 微升移液器吸头。
使用移液管，将一颗种子放入每个测试突变体或基因型的指定方形网格的中心。在这里，使用带有一厘米网格的方形板。这有助于保持每个幼苗之间的均匀距离并避免重叠，这在以后的荧光成像和分析中非常重要。
种子铺好后，将手术胶带缠绕在盖子上以密封，然后将其放入生长室中。植物生长和低二氧化碳处理。在 20 摄氏度下种植植物 7 到 9 天，在每秒每平方米 120 微摩尔的八小时光照周期下种植植物，在 18 摄氏度下在 16 小时的黑暗下种植植物。
在第六天检查植物，以确定它们是否足够大以进行成像。在电镀后的第八天，将植物暴露在低二氧化碳下。 将处理植物置于生长室内的密封盒中，光强度为每秒每平方米200微摩尔，持续12小时。
低CO2条件是使用密封的透明容器构建的，容器底部放置了100克钠石灰。将容器放置在与对照相同的生长室内。对照工厂将在环境二氧化碳中保持每秒每平方米 120 微摩尔含量以下 12 小时。
配置荧光成像系统。在荧光成像系统中以固定距离将测试板放在相机下方的中心。在仪器软件中，导航到实时窗口并选中闪烁框以打开非光化测量闪光。
单击缩放和对焦工具，直到看到完整而清晰的图像。将EL快门的值设置为零并调整灵敏度以获得200至500数字单位范围内的荧光信号。将测光表放在用于调整相机设置的相同位置。
在实时窗口中，选中"超级"框以启动持续 800 毫秒的饱和脉冲。使用滑块调整超级脉冲的相对功率百分比，直到测光表每秒读取每平方米 6， 000 至 8， 000 微摩尔。测量处理样品的量子产率。
处理后，直接用铝箔盖板 15 分钟，以便进行黑暗适应。取下箔片，用脉冲振幅修正荧光计测量光系统二的量子产率。然后将育苗板直接放在相机下方，并运行在我们的 GitHub 存储库中找到的量子产量协议。
从 GitHub 下载量子产量协议。使用荧光计软件通过单击文件夹图标并导航到文件位置来打开程序文件。通过单击红色闪电图标运行量子产量协议。
实验方案完成后，导航到预分析窗口。通过在盘子图像上突出显示每个幼苗的所有像素，将板划分为单独的幼苗。单击"背景排除"以删除任何突出显示的背景像素，仅保留幼苗区域。
单击分析以生成平板图像上每个幼苗的荧光数据。手动调整荧光值范围，以在所有板之间显示一致的最小值和最大值。在"实验"选项卡中，单击"导出"，然后单击"数字"。
单击"数值平均值"以生成包含每个幼苗的量子产量的文本文件。打开文本文件和电子表格进行分析。电子表格包含区域编号、像素大小、Fm、Ft、Fq 和 QY。首先，我们需要将区域编号识别为其相应的基因型，无论是野生型还是测试突变体，结果。
以下是来自野生型和测试突变体的环境和低 CO2 筛选的原始和荧光图像的板图片。每个板都用面积编号标记，相应的荧光读数为量子产率或QY。数据将导出为文本文件，并可在电子表格中打开以进行分析。野生型和突变体的暗适应Fv/Fm量子产率效率通过箱须图可视化。
为了检验野生型和测试突变体的统计差异，使用P值小于0.05的成对T检验。在这里，我们使用量子产率降低的光呼吸突变系Fv/Fm作为测试突变体来检查我们的筛选方法的效率。我们的结果表明，与野生类型相比，测试突变体的量子产量效率显着降低。
这表明我们的筛查方法能够使用低CO2筛查来识别光呼吸道突变体。结论。使用此协议时要记住的重要一点是确保拟南芥幼苗足够大以测量荧光，但不要太大以至于植物在成像过程中会重叠。最好将幼苗想象成第一片真正的叶子，以尽量保持叶子大小和叶角均匀。
该方案可用作幼苗的高通量筛选。每个板的成像相对较快，并且有可能每天筛选超过1，000棵幼苗。叶绿素荧光分析使我们能够使用低CO2筛选来识别光呼吸突变体，这对于维持光呼吸效率非常重要。
该协议不仅限于拟南芥，并且具有非生物胁迫反应实验的潜在用途。
