L’objectif de cette méthode est d’identifier les mutants dans la voie photorespiratoire à l’aide d’un criblage à faible teneur en CO2. Nous présentons une méthode pour identifier les mutants qui perturbent la photorespiration après une exposition à un faible taux de CO2. Un avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’un criblage à haut débit pour les semis qui peut être effectué dans un laps de temps relativement court.
Les sections suivantes fourniront des détails sur la préparation et la stérilisation des semences, la croissance des plantes et le traitement à faible teneur en CO2, la configuration du système d’imagerie par fluorescence, la mesure du rendement quantique des échantillons traités, les résultats représentatifs et les conclusions. Préparation et stérilisation des semences. La préparation des semences consiste en l’absorption et la stérilisation des semences.
Il est important de noter que toutes ces étapes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour maintenir des conditions stériles. Tous les matériaux, réactifs et milieu de croissance nécessaires sont autoclavés. Les lignées de graines utilisées sont plgg1-1, abcb26 et WT ou type sauvage.
Imprégnez les graines dans de l’eau stérile dans une hotte à flux laminaire, puis stratifiez à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant deux jours. Dans des conditions stériles, préparer 10 millilitres de solution d’eau de Javel à 50 % du volume et ajouter environ 20 microlitres de Tween 20. Retirer l’eau des graines imbibées, puis ajouter un millilitre de solution d’eau de Javel dans le tube de microcentrifugation et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Retirer la solution d’eau de Javel à l’aide d’une pipette. Rincez les graines dans un millilitre d’eau stérile pour les remettre en suspension. Retirez l’eau une fois que les graines se sont déposées au fond.
Remettez les graines en suspension dans une solution stérile d’agarose à 0,1%. Pour le placage de semences, plaques de milieu basal avec 1% MS de milieu avec vitamines et 1%gélose pour la culture des mutants d’essai. Coupez une pointe de pipette de 200 microlitres avec une lame de rasoir.
À l’aide d’une pipette, placer une graine au centre de la grille carrée désignée pour chaque mutant ou génotype testé. Ici, une plaque carrée avec une grille d’un centimètre par un est utilisée. Cela permet de maintenir une distance uniforme entre chaque semis et d’éviter les chevauchements, ce qui sera important plus tard dans l’imagerie et l’analyse de fluorescence.
Une fois les graines plaquées, enroulez du ruban chirurgical autour du couvercle pour sceller, puis placez-le dans la chambre de croissance. Croissance des plantes et traitement à faible teneur en CO2. Cultivez des plantes pendant sept à neuf jours à 20 degrés Celsius sous un cycle lumineux de huit heures de 120 micromoles par mètre carré par seconde et 16 heures d’obscurité à 18 degrés Celsius.
Vérifiez les plantes le sixième jour pour déterminer si elles sont assez grandes pour l’imagerie. Le huitième jour après le placage, exposez les plantes à une faible teneur en CO2. Placez les plantes de traitement dans une boîte scellée dans la chambre de croissance avec une intensité lumineuse de 200 micromoles par mètre carré et par seconde pendant 12 heures.
L’état de faible teneur en CO2 a été construit à l’aide d’un récipient transparent étanche à l’air avec 100 grammes de chaux sodée placés dans le fond du récipient. Le conteneur a été placé dans la même chambre de croissance que le témoin. Les usines de contrôle resteront inférieures à 120 micromoles par mètre carré et par seconde dans le CO2 ambiant pendant 12 heures.
Configurez le système d’imagerie par fluorescence. Placez une plaque d’essai centrée sous la caméra à une distance fixe dans le système d’imagerie par fluorescence. Dans le logiciel de l’instrument, accédez à la fenêtre en direct et cochez la case Clignotements pour activer les flashs de mesure non actiniques.
Cliquez sur les outils de zoom et de mise au point jusqu’à ce que vous voyiez une image complète et nette. Réglez la valeur de l’obturateur EL sur zéro et réglez la sensibilité pour obtenir un signal fluorescent compris entre 200 et 500 unités numériques. Placez un posemètre dans la même position que celle utilisée pour régler les paramètres de la caméra.
Dans la fenêtre en direct, cochez la case Super pour démarrer une impulsion saturante d’une durée de 800 millisecondes. Utilisez le curseur pour ajuster le pourcentage de puissance relative de la Super impulsion jusqu’à ce que le posemètre indique 6 000 à 8 000 micromoles par mètre carré et par seconde. Mesurer le rendement quantique des échantillons traités.
Directement après le traitement, couvrir les plaques avec du papier d’aluminium pendant 15 minutes pour une adaptation à l’obscurité. Retirer la feuille pour mesurer le rendement quantique du photosystème deux avec un fluoromètre à amplitude d’impulsion modifiée. Ensuite, placez la plaque de semis directement sous la caméra et exécutez le protocole de rendement quantique trouvé dans notre référentiel GitHub.
Téléchargez le protocole Quantum Yield depuis GitHub. Utilisez un logiciel de fluoromètre pour ouvrir le fichier programme en cliquant sur l’icône du dossier et en naviguant jusqu’à l’emplacement du fichier. Exécutez le protocole de rendement quantique en cliquant sur l’icône d’éclair rouge.
Une fois le protocole terminé, accédez à la fenêtre de pré-analyse. Divisez la plaque en semis individuels en mettant en surbrillance tous les pixels de chaque semis sur l’image de l’assiette. Cliquez sur Exclusion en arrière-plan pour supprimer tous les pixels d’arrière-plan en surbrillance, en ne laissant que la zone de semis.
Cliquez sur Analyser pour générer des données de fluorescence pour chaque semis sur l’image de la plaque. Ajustez manuellement la plage de valeurs de fluorescence pour afficher des valeurs minimales et maximales cohérentes parmi toutes les plaques. Dans l’onglet Expérimenter, cliquez sur Exporter, puis sur Numérique.
Cliquez sur Moyenne numérique pour générer un fichier texte contenant le rendement quantique pour chaque semis. Ouvrez le fichier texte et la feuille de calcul pour analyse. La feuille de calcul contient le numéro de zone, la taille des pixels, Fm, Ft, Fq et QY. Tout d’abord, nous devons identifier le numéro de zone à son génotype correspondant, qu’il s’agisse d’un type sauvage ou d’un mutant test, Résultats.
Voici les photos sur plaque d’images brutes et de fluorescence provenant du criblage ambiant et à faible émission de CO2 de types sauvages et de mutants testés. Chaque plaque est étiquetée par numéro de zone avec des lectures de fluorescence correspondantes comme rendement quantique ou QY. Les données sont exportées sous forme de fichier texte et peuvent être ouvertes dans une feuille de calcul pour analyse. Les rendements quantiques Fv/Fm adaptés à l’obscurité des types sauvages et des mutants sont visualisés par des diagrammes en boîte et en moustaches.
Pour tester la différence statistique entre les types sauvages et les mutants testés, le test T par paires a été utilisé avec une valeur P inférieure à 0,05. Ici, nous utilisons la lignée photorespiratoire mutante à rendement quantique réduit Fv/Fm comme mutant de test pour vérifier l’efficacité de notre méthode de dépistage. Nos résultats montrent que les mutants testés ont une efficacité de rendement quantique significativement inférieure à celle des types sauvages.
Cela indique que notre méthode de dépistage est capable d’identifier les mutants photorespiratoires en utilisant un criblage à faible teneur en CO2. Conclusions. Une chose importante à retenir lors de l’utilisation de ce protocole est de s’assurer que les semis d’Arabidopsis sont assez grands pour mesurer la fluorescence, mais pas assez grands pour que les plantes se chevauchent pendant l’imagerie. Il est préférable d’imager les plantules comme les premières vraies feuilles pour essayer de garder la taille et les angles des feuilles uniformes.
Ce protocole peut être utilisé comme criblage à haut débit pour les semis. L’imagerie de chaque plaque est relativement rapide et a le potentiel de cribler bien plus de 1 000 semis par jour. L’analyse par fluorescence chlorophyllienne nous a permis d’identifier les mutants photorespiratoires à l’aide d’un criblage à faible teneur en CO2, ce qui est important pour maintenir l’efficacité de la photorespiration.
Ce protocole ne se limite pas à Arabidopsis et a le potentiel d’être utilisé pour des expériences de réponse au stress abiotique.
