この方法の目的は、低CO2スクリーニングを使用して光呼吸経路の変異体を特定することです。低CO2曝露後に光呼吸を妨害している変異体を特定する方法を提示します。この方法の利点は、比較的短時間で行うことができる苗のハイスループットスクリーニングであるということです。
次のセクションでは、種子の準備と滅菌、植物の成長と低CO2処理の詳細、蛍光イメージングシステムの構成、処理されたサンプルの量子収率の測定、代表的な結果と結論について説明します。種子の準備と滅菌種子調製は、種子吸収および種子滅菌からなる。
これらのステップはすべて、無菌状態を維持するために層流フードで行われることに注意することが重要です。必要な材料、試薬、および増殖培地はすべてオートクレーブ滅菌されます。使用されるシード系統は、plgg1-1、abcb26、およびWTまたは野生型です。
層流フード内の滅菌水に種子を吸収し、次に暗闇の中で摂氏4度で2日間成層します。無菌条件下で、10ミリリットルの50%容量から体積への漂白剤溶液を調製し、約20マイクロリットルのTween20を追加します。吸収した種子から水を取り除き、1ミリリットルの漂白剤溶液をマイクロ遠心チューブに加え、室温で5分間インキュベートします。
ピペットで漂白剤溶液を取り除きます。種子を1ミリリットルの滅菌水ですすいで再懸濁します。種子が底に落ち着いたら水を取り除きます。
種子を滅菌0.1%アガロース溶液に再懸濁します。種子プレーティングのために、試験変異体の培養のためのビタミンと1%寒天を含む1%MS培地を含む基礎培地プレート。かみそりの刃で200マイクロリットルのピペットチップを切ります。
ピペットを使用して、各試験変異体または遺伝子型について、指定された正方形のグリッドの中央に1つのシードを置きます。ここでは、1つずつセンチメートルのグリッドを持つ正方形のプレートが使用されます。これは、各苗間の距離を均一に保ち、重なりを避けるのに役立ち、これは後の蛍光イメージングと分析で重要になります。
種子がメッキされたら、蓋にサージカルテープを巻き付けて密封し、成長室に置きます。植物の成長と低CO2処理。毎秒120マイクロモル/平方メートルの8時間の光サイクルと摂氏18度で16時間の暗闇の下で、摂氏20度で7〜9日間植物を育てます。
6日目に植物をチェックして、イメージングに十分な大きさかどうかを判断します。めっき後8日目に、植物を低CO2にさらします。 処理プラントを成長チャンバー内の密閉ボックスに入れ、毎秒200マイクロモル/メートル平方の光強度で12時間配置します。
低CO2条件は、容器の底に100グラムのソーダライムを入れた気密透明容器を使用して構築されました。容器をコントロールと同じ成長チャンバー内に配置した。制御プラントは、周囲CO2で12時間、毎秒120マイクロモル/メートル平方未満にとどまります。
蛍光イメージングシステムを構成します。蛍光イメージングシステムのカメラの下に一定の距離でテストプレートを配置します。機器ソフトウェア内で、ライブウィンドウに移動し、点滅チェックボックスをオンにして、非活性測定フラッシュをオンにします。
完全で鮮明な画像が表示されるまで、ズームツールとフォーカスツールをクリックします。ELシャッターの値をゼロに設定し、感度を調整して、200〜500デジタル単位の範囲の蛍光信号を取得します。カメラの設定を調整するのと同じ位置に露出計を置きます。
ライブウィンドウで、チェックボックスをオンにします スーパー 800ミリ秒続く飽和パルスを開始します。スライダーを使用して、露出計が毎秒6, 000〜8, 000マイクロモル/平方メートルを読み取るまで、スーパーパルスの相対電力のパーセンテージを調整します。処理されたサンプルの量子収率を測定します。
治療の直後に、暗順応のために15分間アルミホイルでプレートを覆います。箔を取り除き、パルス振幅修正蛍光光度計で光化学系2の量子収率を測定した。次に、苗プレートをカメラの真下に置き、GitHubリポジトリにある量子収量プロトコルを実行します。
GitHub から Quantum Yield Protocol をダウンロードします。蛍光光度計ソフトウェアを使用して、フォルダアイコンをクリックしてファイルの場所に移動してプログラムファイルを開きます。赤い稲妻アイコンをクリックして、量子収率プロトコルを実行します。
プロトコルが完了したら、分析前ウィンドウに移動します。プレート画像上の各苗のすべてのピクセルを強調表示して、プレートを個々の苗に分割します。[背景の除外] をクリックして、強調表示された背景ピクセルを削除し、苗領域だけを残します。
[分析] をクリックして、プレート画像上の各苗の蛍光データを生成します。蛍光値の範囲を手動で調整して、すべてのプレート間で一貫した最小値と最大値を表示します。[実験] タブで、[エクスポート]、[数値] の順にクリックします。
[数値平均] をクリックして、各苗の量子収量を含むテキスト ファイルを生成します。分析のためにテキスト ファイルとスプレッドシートを開きます。スプレッドシートには、エリア番号、ピクセルのサイズ、Fm、Ft、Fq、およびQYが含まれています。まず、野生型か試験変異型かにかかわらず、対応する遺伝子型の領域番号を特定する必要があります。
これは、野生型および試験変異体の周囲および低CO2スクリーニングからの生および蛍光画像のプレート写真です。各プレートは、対応する蛍光測定値を量子収率またはQYとして領域番号で標識します。データはテキストファイルとしてエクスポートされ、分析のためにスプレッドシートで開くことができます。野生型と変異体の暗順応Fv/Fm量子収率効率は、箱ひげ図とウィスカープロットによって視覚化されます。
野生型と試験変異体の統計的差を検定するために、0.05未満のP値を有するペアワイズT検定を使用した。ここでは、量子収率Fv/Fmが低下した光呼吸変異株を試験変異株として使用し、スクリーニング法の効率を確認します。私たちの結果は、テスト変異体が野生型と比較して有意に低い量子収率を持っていることを示しています。
これは、我々のスクリーニング法が低CO2スクリーニングを用いて光呼吸変異体を同定できることを示しています。結論。このプロトコルを使用する際に覚えておくべき重要なことは、シロイヌナズナの苗が蛍光を測定するのに十分な大きさであるが、イメージング中に植物が重なるほど大きくないことを確認することです。葉の大きさと葉の角度を均一に保つために、苗を最初の本物の葉としてイメージすることが好ましい。
このプロトコルは、苗木のハイスループットスクリーニングとして使用できます。各プレートのイメージングは比較的迅速で、1日あたり1, 000本をはるかに超える苗木をスクリーニングする可能性があります。クロロフィル蛍光解析により、光呼吸効率の維持に重要な低CO2スクリーニングを用いて光呼吸変異体を同定することができました。
このプロトコルはシロイヌナズナに限定されず、非生物的ストレス応答実験に使用できる可能性があります。
