המטרה של שיטה זו היא לזהות מוטציות במסלול הפוטו-רויטריאליסטי באמצעות בדיקת CO2 נמוכה. אנו מציגים שיטה לזיהוי מוטציות המשבשות את הפוטו-רספירציה לאחר חשיפה ל-CO2 נמוך. יתרון של שיטה זו הוא שמדובר בסינון תפוקה גבוהה לשתילים שניתן לעשות בפרק זמן קצר יחסית.
הסעיפים הבאים יספקו פרטים על הכנת זרעים ועיקורם, גידול צמחים וטיפול נמוך ב- CO2, יגדירו את מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית, ימדדו את התשואה הקוונטית של דגימות מטופלות, תוצאות מייצגות ומסקנות. הכנת זרעים ועיקור. הכנת הזרעים מורכבת מהטמעת זרעים ועיקור זרעים.
חשוב לציין כי כל השלבים הללו נעשים במכסה מנוע זרימה למינרי כדי לשמור על תנאים סטריליים. כל החומרים הדרושים, ריאגנטים, ומדיום הצמיחה הם autoclaved. קווי הזרעים המשמשים הם plgg1-1, abcb26, ו- WT או סוג פראי.
יש לשאוב זרעים במים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית, ואז לרבד בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך יומיים. בתנאים סטריליים, הכינו 10 מיליליטר בנפח של 50% לתמיסת אקונומיקה בנפח והוסיפו כ-20 מיקרוליטרים של Tween 20. הסר מים מזרעים imbibed, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת אקונומיקה לתוך צינור microcentrifuge ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
מוציאים את תמיסת האקונומיקה בעזרת פיפטה. שטפו את הזרעים במיליליטר אחד של מים סטריליים להחייאה. הסר את המים לאחר שהזרעים התיישבו לתחתית.
יש להשהות זרעים בתמיסת אגרוז סטרילית של 0.1%. לציפוי זרעים, צלחות בינוניות בסיסיות עם 1% MS בינוניות עם ויטמינים ו-1% אגר לטיפוח מוטציות הבדיקה. חותכים קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם סכין גילוח.
באמצעות פיפטה, הניחו זרע אחד במרכז הרשת המרובעת המיועדת לכל מוטציה או גנוטיפ בדיקה. כאן, צלחת מרובעת עם רשת אחד על סנטימטר משמש. זה עוזר לשמור על מרחק אחיד בין כל שתיל ולמנוע חפיפה, אשר יהיה חשוב מאוחר יותר בהדמיה פלואורסצנטית וניתוח.
לאחר שהזרעים צופו, עטפו סרט כירורגי סביב המכסה כדי לאטום אותו, ואז הניחו אותו בתא הצמיחה. צמיחת צמחים וטיפול נמוך ב- CO2. לגדל צמחים במשך שבעה עד תשעה ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במחזור אור של שמונה שעות של 120 מיקרומולים למטר מרובע לשנייה ו-16 שעות חושך ב-18 מעלות צלזיוס.
בדוק צמחים ביום השישי כדי לקבוע אם הם גדולים מספיק להדמיה. ביום השמיני לאחר הציפוי, חשפו את הצמחים ל-CO2 נמוך. הניחו את מתקני הטיפול בקופסה אטומה בתוך תא הגידול בעוצמת אור של 200 מיקרומולים למטר רבוע לשנייה למשך 12 שעות.
מצב ה-CO2 הנמוך נבנה באמצעות מיכל שקוף אטום עם 100 גרם של סיד סודה שהונח בתחתית המיכל. המיכל הונח בתוך אותו תא גידול כמו הבקרה. מתקני הבקרה יישארו מתחת ל-120 מיקרומולים למטר רבוע לשנייה ב-CO2 סביבתי למשך 12 שעות.
הגדר את מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית. הנח לוחית בדיקה מרוכזת מתחת למצלמה במרחק קבוע במערכת ההדמיה הפלואורסצנטית. בתוך תוכנת המכשיר, נווט אל החלון החי וסמן את התיבה Flashes כדי להפעיל הבזקי מדידה שאינם אקטיניים.
לחץ על כלי הזום והמיקוד עד שתראה תמונה מלאה וחדה. הגדר את הערך של תריס EL לאפס וכוונן את הרגישות כדי לקבל אות פלואורסצנטי בטווח של 200 עד 500 יחידות דיגיטליות. מקם מד אור באותו מיקום המשמש להתאמת הגדרות המצלמה.
בחלון החי, סמן את התיבה סופר כדי להתחיל פולס רווי שנמשך 800 אלפיות השנייה. השתמש במחוון כדי להתאים את אחוז ההספק היחסי של פולס העל עד שמד האור יקרא 6, 000 עד 8, 000 מיקרומולים למ"ר לשנייה. מדידת תפוקה קוונטית של דגימות מטופלות.
מיד לאחר הטיפול, יש לכסות את הצלחות בנייר אלומיניום למשך 15 דקות להסתגלות חשוכה. הסר רדיד אלומיניום כדי למדוד את התפוקה הקוונטית של פוטוסיסטם שתיים באמצעות משרעת פולסים שונה פלואורומטר. לאחר מכן הנח את צלחת השתיל ישירות מתחת למצלמה והפעל את פרוטוקול התפוקה הקוונטית שנמצא במאגר GitHub שלנו.
הורד את פרוטוקול התשואה הקוונטית מ- GitHub. השתמש בתוכנת פלואורומטר כדי לפתוח את קובץ התוכנית על ידי לחיצה על סמל התיקייה וניווט למיקום הקובץ. הפעל את פרוטוקול התשואה הקוונטית על ידי לחיצה על סמל הברק האדום.
לאחר השלמת הפרוטוקול, נווט אל חלון טרום הניתוח. חלק את הצלחת לשתילים בודדים על-ידי הדגשת כל הפיקסלים עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. לחץ על אי-הכללת רקע כדי להסיר פיקסלים מסומנים ברקע, ולהשאיר רק את אזור השתיל.
לחץ על נתח כדי ליצור נתוני פלואורסצנציה עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. התאם ידנית את טווח הערכים הפלואורסצנטיים כדי להציג ערכי מינימום ומקסימום עקביים בין כל הלוחות. בכרטיסיה ניסוי, לחץ על יצא ולאחר מכן על מספרי.
לחץ על ממוצע מספרי כדי ליצור קובץ טקסט המכיל את התפוקה הקוונטית עבור כל שתיל. פתח את קובץ הטקסט והגיליון האלקטרוני לניתוח. הגיליון האלקטרוני מכיל את מספר האזור, גודל הפיקסלים, Fm, Ft, Fq ו- QY. ראשית, עלינו לזהות את מספר האזור לגנוטיפ המתאים לו, בין אם סוג בר או מוטציה של בדיקה, תוצאות.
להלן תמונות הלוחות של תמונות גולמיות ופלואורסצנטיות מסינון סביבתי ו-CO2 נמוך של סוגי בר ומוטציות בדיקה. כל לוח מסומן לפי מספר שטח עם קריאות פלואורסצנטיות מתאימות כתפוקה קוונטית או QY. הנתונים מיוצאים כקובץ טקסט וניתן לפתוח אותם בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. יעילות התפוקה הקוונטית של Fv/Fm המותאמת לחושך של סוגי בר ומוטנטים מדומה על ידי חלקות קופסה ושפם.
כדי לבחון את ההבדל הסטטיסטי בין סוגי בר ומוטציות בדיקה, נעשה שימוש במבחן T זוגי עם ערך P של פחות מ-0.05. כאן, אנו משתמשים בקו המוטציה הפוטו-טרנסציונלית עם תפוקה קוונטית מופחתת Fv/Fm כמוטנט בדיקה כדי לבדוק את היעילות של שיטת הסינון שלנו. התוצאות שלנו מראות שלמוטציות הבדיקה יש יעילות תפוקה קוונטית נמוכה משמעותית בהשוואה לסוגים הפראיים.
זה מצביע על כך ששיטת הסינון שלנו מסוגלת לזהות מוטציות פוטו-רציפות באמצעות סינון CO2 נמוך. מסקנות. דבר חשוב שיש לזכור בעת השימוש בפרוטוקול זה הוא לוודא כי שתילי Arabidopsis הם גדולים מספיק כדי למדוד פלואורסצנציה, אבל לא כל כך גדול כי הצמחים יחפפו במהלך הדמיה. עדיף לדמות את השתילים כעלים האמיתיים הראשונים כדי לנסות לשמור על גודל העלה וזוויות העלים אחידים.
פרוטוקול זה יכול לשמש כסינון תפוקה גבוהה עבור שתילים. הדמיה של כל צלחת היא מהירה יחסית ויש לה פוטנציאל לסנן הרבה מעל 1, 000 שתילים ליום. ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל אפשר לנו לזהות מוטציות פוטו-טרנסמיטיביות באמצעות בדיקת CO2 נמוכה, החשובה לשמירה על יעילות הפוטו-נשימה.
פרוטוקול זה אינו מוגבל לערבידופסיס ויש לו פוטנציאל לשימוש בניסויי תגובה ללחץ אביוטי.
