이 방법의 목표는 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 경로에서 돌연변이를 식별하는 것입니다. 우리는 낮은 CO2에 노출 된 후 광호흡을 방해하는 돌연변이를 식별하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 장점은 비교적 짧은 시간에 수행 할 수있는 묘목에 대한 높은 처리량 스크리닝이라는 것입니다.
다음 섹션에서는 종자 준비 및 살균, 식물 성장 및 낮은 CO2 처리, 형광 이미징 시스템 구성, 처리된 샘플의 양자 수율 측정, 대표 결과 및 결론에 대한 세부 정보를 제공합니다. 종자 준비 및 살균. 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다.
이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 필요한 모든 물질, 시약 및 성장 배지가 오토클레이브됩니다. 사용되는 시드 라인은 plgg1-1, abcb26 및 WT 또는 와일드 타입입니다.
층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수 한 다음 어둠 속에서 섭씨 4도에서 이틀 동안 층화합니다. 멸균 조건 하에서, 10 밀리리터의 50 % 부피 표백제 용액을 준비하고 약 20 마이크로 리터의 트윈 20을 첨가한다. 흡수 된 씨앗에서 물을 제거한 다음 표백제 용액 1 밀리리터를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
피펫으로 표백제를 제거하십시오. 씨앗을 멸균 된 물 1 밀리리터로 헹구어 다시 현탁하십시오. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을 제거하십시오.
멸균 된 0.1 % 아가 로스 용액에 씨앗을 재현 탁하십시오. 종자 도금의 경우, 비타민이 함유된 1%MS 배지와 시험 돌연변이체 재배를 위한 1%한천이 있는 기초 배지 플레이트. 면도날로 200 마이크로 리터 피펫 팁을 자릅니다.
피펫을 사용하여 각 테스트 돌연변이 또는 유전자형에 대해 지정된 사각형 그리드의 중앙에 하나의 시드를 놓습니다. 여기에서는 1 센티미터 그리드가있는 사각형 플레이트가 사용됩니다. 이것은 각 묘목 사이의 균일 한 거리를 유지하고 겹치는 것을 방지하는 데 도움이되며, 이는 나중에 형광 이미징 및 분석에서 중요합니다.
씨앗이 플레이팅되면 뚜껑 주위에 수술 테이프를 감아 밀봉 한 다음 성장 챔버에 넣습니다. 식물 성장 및 낮은 CO2 처리. 초당 평방 미터당 120 마이크로 몰의 8 시간 빛주기와 섭씨 18도에서 16 시간의 어둠 속에서 섭씨 20도에서 7-9 일 동안 식물을 재배합니다.
여섯째 날에 식물을 확인하여 이미징하기에 충분히 큰지 확인하십시오. 도금 후 8 일째에 식물을 낮은 CO2에 노출시킵니다. 처리 식물을 12 시간 동안 초당 평방 미터당 200 마이크로 몰의 광도로 성장 챔버 내의 밀폐 된 상자에 넣습니다.
낮은 CO2 조건은 용기 바닥에 소다 석회 100g을 놓은 밀폐 투명 용기를 사용하여 구성되었습니다. 용기를 대조군과 동일한 성장 챔버 내에 두었다. 제어 플랜트는 120시간 동안 주변 CO2에서 초당 평방 미터당 12마이크로몰 미만으로 유지됩니다.
형광 이미징 시스템을 구성합니다. 형광 이미징 시스템에서 고정된 거리에 카메라 아래 중앙에 테스트 플레이트를 놓습니다. 계측기 소프트웨어 내에서 라이브 창으로 이동하고 깜박임 확인란을 선택하여 비화학선 측정 플래시를 켭니다.
완전하고 선명한 이미지가 보일 때까지 확대/축소 및 초점 도구를 클릭합니다. EL 셔터 값을 0으로 설정하고 감도를 조정하여 200에서 500 디지털 단위 범위의 형광 신호를 얻습니다. 카메라 설정을 조정하는 데 사용된 것과 동일한 위치에 조도계를 놓습니다.
라이브 창에서 Super 상자를 선택하여 800밀리초 동안 지속되는 포화 펄스를 시작합니다. 슬라이더를 사용하여 광계가 초당 평방 미터당 6, 000에서 8, 000 마이크로 몰을 읽을 때까지 슈퍼 펄스의 상대 전력 비율을 조정하십시오. 처리된 샘플의 양자 수율을 측정합니다.
치료 직후, 어두운 적응을 위해 15 분 동안 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 호일을 제거하여 펄스 진폭 수정 형광계로 광계 2의 양자 수율을 측정하였다. 그런 다음 묘목 플레이트를 카메라 바로 아래에 놓고 GitHub 리포지토리에 있는 양자 수율 프로토콜을 실행합니다.
GitHub에서 퀀텀 수율 프로토콜을 다운로드합니다. 형광계 소프트웨어를 사용하여 폴더 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 프로그램 파일을 엽니 다. 빨간색 번개 아이콘을 클릭하여 퀀텀 수율 프로토콜을 실행합니다.
프로토콜이 완료되면 사전 분석 창으로 이동합니다. 플레이트 이미지에서 각 묘목에 대한 모든 픽셀을 강조 표시하여 플레이트를 개별 묘목으로 분할합니다. 배경 제외를 클릭하여 강조 표시된 배경 픽셀을 제거하고 묘목 영역만 남깁니다.
분석을 클릭하여 플레이트 이미지의 각 묘목에 대한 형광 데이터를 생성합니다. 형광 값 범위를 수동으로 조정하여 모든 플레이트에서 일관된 최소값과 최대값을 표시합니다. 실험 탭에서 내보내기를 클릭하고 숫자를 클릭합니다.
숫자 평균을 클릭하여 각 묘목에 대한 양자 수율이 포함된 텍스트 파일을 생성합니다. 분석을 위해 텍스트 파일과 스프레드시트를 엽니다. 스프레드시트에는 영역 번호, 픽셀 크기, Fm, Ft, Fq 및 QY가 포함됩니다. 먼저, 야생형이든 시험 돌연변이이든 해당 유전자형에 대한 영역 번호를 식별해야 합니다.
다음은 야생형 및 테스트 돌연변이체의 주변 및 낮은 CO2 스크리닝에서 얻은 원시 및 형광 이미지의 플레이트 사진입니다. 각 플레이트는 해당 형광 판독값이 양자 수율 또는 QY로 영역 번호로 표시됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다. 야생형과 돌연변이체의 어두운 적응 Fv/Fm 양자 수율 효율은 상자 및 수염 플롯으로 시각화됩니다.
야생형과 시험 돌연변이체의 통계적 차이를 검정하기 위해, 0.05 미만의 P 값으로 쌍별 T-검정을 사용하였다. 여기에서는 양자 수율이 감소된 광호흡 돌연변이 Fv/Fm 라인을 테스트 돌연변이체로 사용하여 스크리닝 방법의 효율성을 확인합니다. 우리의 결과는 테스트 돌연변이가 야생형에 비해 양자 수율 효율이 현저히 낮다는 것을 보여줍니다.
이는 당사의 스크리닝 방법이 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 돌연변이를 식별할 수 있음을 나타냅니다. 결론. 이 프로토콜을 사용하는 동안 기억해야 할 중요한 사항은 Arabidopsis 묘목이 형광을 측정할 만큼 충분히 크지만 이미징 중에 식물이 겹칠 정도로 크지 않은지 확인하는 것입니다. 잎 크기와 잎 각도를 균일하게 유지하기 위해 묘목을 첫 번째 진정한 잎으로 이미지화하는 것이 바람직합니다.
이 프로토콜은 묘목에 대한 높은 처리량 스크리닝으로 사용할 수 있습니다. 각 판의 이미징은 비교적 빠르며 하루에 1, 000 개가 넘는 묘목을 스크리닝 할 수 있습니다. 엽록소 형광 분석을 통해 광호흡 효율을 유지하는 데 중요한 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 돌연변이를 식별할 수 있었습니다.
이 프로토콜은 Arabidopsis에 국한되지 않으며 비 생물 적 스트레스 반응 실험에 잠재적으로 사용됩니다.
