O objetivo deste método é identificar mutantes na via fotorrespiratória usando uma triagem de baixo CO2. Apresentamos um método para identificar mutantes que estão interrompendo a fotorrespiração após a exposição a baixo CO2. Uma vantagem deste método é que é uma triagem de alto rendimento para mudas que pode ser feita em um período relativamente curto de tempo.
As seções a seguir fornecerão detalhes sobre preparação e esterilização de sementes, crescimento de plantas e tratamento de baixo CO2, configurar o sistema de imagem de fluorescência, medir o rendimento quântico de amostras tratadas, resultados representativos e conclusões. Preparação e esterilização de sementes. A preparação de sementes consiste na absorção e esterilização de sementes.
É importante notar que todas essas etapas são feitas em um exaustor de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Todos os materiais, reagentes e meios de crescimento necessários são autoclavados. As linhas de sementes utilizadas são plgg1-1, abcb26 e WT ou tipo selvagem.
Absorva as sementes em água estéril em um exaustor de fluxo laminar e, em seguida, estratificar a quatro graus Celsius no escuro por dois dias. Em condições estéreis, prepare 10 mililitros de 50% volume a volume de solução de água sanitária e adicione aproximadamente 20 microlitros de Tween 20. Retire a água das sementes embebidas, adicione um mililitro de solução de água sanitária no tubo de microcentrífuga e incube à temperatura ambiente por cinco minutos.
Retire a solução de lixívia com uma pipeta. Lave as sementes em um mililitro de água estéril para ressuspender. Remova a água uma vez que as sementes tenham se depositado no fundo.
Ressuspender sementes em solução estéril de 0,1%agarose. Para o revestimento de sementes, placas basais de meio com 1%MS com vitaminas e 1% de ágar para o cultivo dos mutantes de teste. Corte uma ponta de pipeta de 200 microlitros com uma lâmina de barbear.
Usando uma pipeta, coloque uma semente no centro da grade quadrada designada para cada mutante ou genótipo de teste. Aqui, uma placa quadrada com uma grade de um por um centímetro é usada. Isso ajuda a manter uma distância uniforme entre cada plântula e evitar sobreposições, o que será importante mais tarde na imagem e análise de fluorescência.
Uma vez que as sementes tenham sido chapeadas, enrole a fita cirúrgica ao redor da tampa para selar e, em seguida, coloque-a na câmara de crescimento. Crescimento das plantas e baixo tratamento com CO2. Cultive plantas por sete a nove dias a 20 graus Celsius sob um ciclo de luz de oito horas de 120 micromoles por metro quadrado por segundo e 16 horas de escuridão a 18 graus Celsius.
Verifique as plantas no sexto dia para determinar se elas são grandes o suficiente para imagens. No oitavo dia após o revestimento, expor as plantas a baixo CO2. Coloque as estações de tratamento em uma caixa selada dentro da câmara de crescimento com uma intensidade leve de 200 micromoles por metro quadrado por segundo durante 12 horas.
A condição de baixo CO2 foi construída usando um recipiente transparente hermético com 100 gramas de cal sodada colocada no fundo do recipiente. O recipiente foi colocado dentro da mesma câmara de crescimento que o controle. As plantas de controle permanecerão abaixo de 120 micromoles por metro quadrado por segundo em CO2 ambiente por 12 horas.
Configure o sistema de imagem de fluorescência. Coloque uma placa de teste centralizada sob a câmera a uma distância fixa no sistema de imagem de fluorescência. Dentro do software do instrumento, navegue até a janela ao vivo e marque a caixa Flashes para ativar flashes de medição não actínicos.
Clique nas ferramentas de zoom e foco até ver uma imagem completa e nítida. Defina o valor do obturador EL como zero e ajuste a sensibilidade para obter um sinal fluorescente na faixa de 200 a 500 unidades digitais. Coloque um medidor de luz na mesma posição usada para ajustar as configurações da câmera.
Na janela ao vivo, marque a caixa Super para iniciar um pulso de saturação com duração de 800 milissegundos. Use o controle deslizante para ajustar a porcentagem de potência relativa para o super pulso até que o medidor de luz leia 6.000 a 8.000 micromoles por metro quadrado por segundo. Medir o rendimento quântico das amostras tratadas.
Logo após o tratamento, cubra as placas com papel alumínio por 15 minutos para adaptação ao escuro. Remova a folha para medir o rendimento quântico do fotossistema dois com um fluorômetro modificado por amplitude de pulso. Em seguida, coloque a placa de mudas diretamente sob a câmera e execute o protocolo de rendimento quântico encontrado em nosso repositório GitHub.
Baixe o Quantum Yield Protocol do GitHub. Use um software fluorômetro para abrir o arquivo de programa clicando no ícone de pasta e navegando até o local do arquivo. Execute o protocolo de rendimento quântico clicando no ícone de relâmpago vermelho.
Após a conclusão do protocolo, navegue até a janela de pré-análise. Particione a placa em mudas individuais, destacando todos os pixels de cada muda na imagem da placa. Clique em Exclusão de plano de fundo para remover todos os pixels de plano de fundo realçados, deixando apenas a área de muda.
Clique em analisar para gerar dados de fluorescência para cada muda na imagem da placa. Ajuste manualmente o intervalo de valores de fluorescência para exibir valores mínimos e máximos consistentes entre todas as placas. Na guia Experimento, clique em Exportar e, em seguida, em Numérico.
Clique em Média Numérica para gerar um arquivo de texto contendo o rendimento quântico para cada muda. Abra o arquivo de texto e a planilha para análise. A planilha contém o número da área, o tamanho dos pixels, Fm, Ft, Fq e QY. Primeiro, precisamos identificar o número de área para o genótipo correspondente, seja do tipo selvagem ou de um mutante de teste, Resultados.
Aqui estão as imagens de placas de imagens brutas e de fluorescência da triagem ambiente e de baixo CO2 de tipos selvagens e mutantes de teste. Cada placa é marcada por número de área com leituras de fluorescência correspondentes como rendimento quântico ou QY. Os dados são exportados como um arquivo de texto e podem ser abertos em uma planilha para análise. As eficiências de rendimento quântico Fv/Fm adaptadas ao escuro de tipos selvagens e mutantes são visualizadas por gráficos de caixa e bigode.
Para testar a diferença estatística dos tipos silvestres e testar os mutantes, foi utilizado o teste T pareado, com valor de P inferior a 0,05. Aqui, usamos a linha mutante fotorrespiratória com rendimento quântico reduzido Fv/Fm como um mutante de teste para verificar a eficiência do nosso método de triagem. Nossos resultados mostram que os mutantes de teste têm uma eficiência de rendimento quântico significativamente menor em comparação com os tipos selvagens.
Isso indica que nosso método de triagem é capaz de identificar mutantes fotorrespiratórios usando triagem de baixo CO2. Conclusões. Uma coisa importante a lembrar ao usar este protocolo é certificar-se de que as mudas de Arabidopsis são grandes o suficiente para medir a fluorescência, mas não tão grandes que as plantas se sobreponham durante a imagem. Prefere-se fotografar as mudas como as primeiras folhas verdadeiras para tentar manter o tamanho da folha e os ângulos das folhas uniformes.
Este protocolo pode ser usado como uma triagem de alto rendimento para mudas. A imagem de cada placa é relativamente rápida e tem o potencial de rastrear mais de 1.000 mudas por dia. A análise de fluorescência de clorofila permitiu identificar mutantes fotorrespiratórios usando uma triagem de baixo CO2, o que é importante para manter a eficiência da fotorrespiração.
Este protocolo não se limita à Arabidopsis e tem o uso potencial para experimentos de resposta ao estresse abiótico.
