Амилоидные бляшки необходимы для диагностики болезни Альцгеймера. Однако их недостаточно. Несмотря на этот факт, они остаются загадочными отчасти из-за проблем в характеристике их содержания.
Наш протокол очень эффективен при выделении амилоидных фибрилл высокой чистоты и хорошо подходит для понимания мелких деталей структуры и состава. Знание содержания белка в амилоидных бляшках может помочь определить цели терапевтического вмешательства, которые могут задерживать, мешать или предотвращать их накопление. Поэтому затягивается начало заболевания.
Этот метод хорошо подходит для извлечения белковых отложений из дегенерированных тканей мозга и белковых агрегатов в различных других белковых путях. Начните с помещения свежерассеченной или замороженной области мозговой ткани в двухмиллилитровую трубку, содержащую шесть-восемь керамических шариков, в свежеприготовленный буфер гомогенизации ледяного холода. Затем измельчите ткань с помощью гомогенизатора шариковой мельницы со скоростью 4 000 оборотов в минуту с двумя циклами по 30 секунд включения и выключения импульса.
Теперь добавьте девять миллилитров буфера гомогенизации ледяного холода к одному миллилитру гомогената мозговой ткани и 15-миллилитровой трубке и запечатайте полосками лабораторной восковой пленки. Чтобы обеспечить надежную солюбилизацию, держите трубку вращающейся в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день добавьте твердую сахарозу к суспензии тканевого экстракта до конечной концентрации 1,2 моля.
Хорошо перемешать и центрифуга имела 250 000 х г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах буфера гомогенизации, содержащего 1,9 молярной сахарозы методом тритурации и центрифуги при 125 000 х г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования переложите верхний белый твердый слой в свежую трубку и солюбилизируйте один миллилитр ледяного буфера холодной промывки, несколько раз поглаживая вверх и вниз.
Поскольку гранула также обогащена амилоидными фибриллами, отбросьте водный средний слой и соедините гранулу с верхним слоем для получения более высокого выхода. Центрифугируйте комбинированные фракции по 8 000 х г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После выброса супернатанта повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре ледяного буфера пищеварения и инкубируют при комнатной температуре в течение трех часов на вихре.
Снова центрифугируйте образец, затем дважды промыть гранулу в одном миллилитре ледяного холодного буфера Tris и снова центрифуги. После второй промывки повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера солюбилизации путем пипетки вверх и вниз и быстро центрифугируйте трубку при 200 000 х г в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Сохраните гранулу, затем уменьшите концентрацию сахарозы с 1,3 до одного моляра, добавив к супернатанту 50 миллимолярных трисовых буферов.
Снова центрифугируют супернатант, затем растворяют как гранулы, так и 100 микролитров буфера Tris, содержащего 0,5% SDS. Для очистки амилоида солюбилизируйте богатые амилоидом гранулы с помощью ультразвуковых волн в устройстве обработки ультразвуком в ванне в течение 20 циклов, затем немедленно центрифугируйте материал при 20 000 х г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах 0,5% буфера SDS Tris и повторите промывку еще четыре раза, После заключительной стадии центрифугирования вымойте гранулу в 200 микролитрах сверхчистой воды и центрифуги 20 000 х г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить все оставшееся моющее средство.
Растворите конечную гранулу, содержащую очищенные амилоидные фибриллы, в 100 микролитрах сверхчистой воды. Растворить очищенные 100 микролитров амилоидных фибрилл в 400 микролитрах метанола и вихревой скважине. Затем смешайте в 100 микролитрах хлороформа и снова вихрь.
Затем добавьте 300 микролитров сверхчистой воды и тщательно вихрь. После центрифугирования при 12 000 х г в течение двух минут при комнатной температуре аккуратно удалите верхний водный слой, не нарушая интерфейсный слой, содержащий белковую чешуйку, и снова добавьте тот же объем метанола. Повторите центрифугирование, выбросьте супернатант и высушите гранулу на воздухе.
Для пищеварения растворите гранулы в 50 микролитрах буфера гуанидина гидрохлорида и сконзвуком на ледяной водяной бане. Затем тщательно вихрь в течение 45 минут до одного часа при комнатной температуре, добавьте 50 микролитров 0,2% раствора поверхностно-активного вещества и снова вихрь еще 60 минут. Далее добавляют один микролитр 500 миллимоляров TCEP и инкубируют в течение 60 минут.
Затем добавляют два микролитра 500 миллимолярного йодоацетамида и инкубируют в темноте в течение 20 минут. После инкубации закаляют йодоацетамид пятью микролитрами раствора TCEP в течение 15 минут. Далее добавляют в пробирку необходимый объем 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония для снижения концентрации гуанидина до 1,5 мол.
Кроме того, добавьте в трубку 1% раствор поверхностно-активного вещества. Затем добавьте трипсин и оставьте трубку перемешивать при 37 градусах Цельсия на ночь. На следующий день добавьте муравьиную кислоту в переваренный пептидный раствор для снижения рН до 2,0, затем активируйте спиновую колонку C18, добавив 200 микролитров 50% раствора метанола и вращая при 1500 х г в течение двух минут при комнатной температуре.
Затем уравновешивайте слои смолы C18, добавляя 200 микролитров буфера равновесия и снова вращаясь в течение двух минут. После уравновешивания загружают подкисленный пептидный раствор на колонку С18 и центрифугу при 1500 х г в течение двух минут при комнатной температуре. Перезагрузите поток, раскрутите столбец и отбросьте второй поток.
Затем дважды промыть пептиды, связанные со смолой C18, с помощью промывочного буфера. Элюируют пептид три раза, добавляя 40 микролитров буфера элюирования и центрифугируя колонку. Высушите пептиды в быстром вакуумном концентраторе путем выпаривания водного раствора.
Сухие гранулы можно сохранить при температуре 20 градусов Цельсия в течение нескольких недель до анализа РС. Конго красное окрашивание очищенных амилоидов документирует обогащение амилоидных фибрилл по сравнению с растворимой фракцией SDS. Растворимая фракция SDS не показала присутствия амилоидов.
Структура очищенных фибрилл подтвердила наличие почти чистых амилоидных фибрилл. Кроме того, маркировка иммунозолотого подтвердила наличие амилоидных бета-42 пептидов. Окрашивание с использованием антиамилоидных бета-42 и антифибрильных антител показало относительное обилие амилоидных бета-42 пептидов в фибриллах.
Очищенные амилоидные фракции показали наличие примерно 250 белков, в то время как фракция, собранная перед ультразвуком и промывкой SDS, содержала более 2 500 белков. Ядра Фибриля показали обогащение белков, связанных с немембранными органеллами и супрамолекулярными комплексами. Амилоиды являются видами с низкой численностью, возможно, от нескольких пикограмм до нескольких микрограммов на миллиграммы тканей мозга.
Поэтому нужно быть очень осторожным при подборе слоев, поддонов или выбрасывании супернатанта. С развитием этой методики теперь можно более уверенно идентифицировать белки, связанные с исходными амилоидными семенами, охарактеризовать их структуру и нацелить их на терапевтическое вмешательство. Поэтому предотвращая начало этого смертельно опасного заболевания.
