Amyloid-Plaques sind für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit erforderlich. Sie sind jedoch nicht ausreichend. Trotz dieser Tatsache bleiben sie rätselhaft, was zum Teil auf die Herausforderungen bei der Charakterisierung ihres Inhalts zurückzuführen ist.
Unser Protokoll ist hocheffizient bei der Isolierung von Amyloidfibrillen bei hoher Reinheit und eignet sich gut, um die feinen Details von Struktur und Zusammensetzung zu verstehen. Die Kenntnis des Proteingehalts von Amyloid-Plaques kann helfen, die Ziele der therapeutischen Intervention zu identifizieren, die ihre Ansammlung verzögern, stören oder verhindern können. Daher verzögert sich der Ausbruch der Krankheit.
Diese Methode eignet sich gut zur Extraktion von Proteinablagerungen aus degeneriertem Hirngewebe und Proteinaggregaten in verschiedenen anderen Proteinwegen. Beginnen Sie damit, eine frisch sezierte oder eingefrorene Hirngeweberegion in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit sechs bis acht Keramikperlen in frisch zubereiteten eiskalten Homogenisierungspuffer zu legen. Mahlen Sie dann das Gewebe mit einem Rührwerkshomogenisator bei 4.000 U / min mit zwei Zyklen von 30 Sekunden Ein- und Ausschaltimpuls.
Nun neun Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem einen Milliliter Hirngewebehomogenat und einem 15 Milliliter Tubus hinzufügen und mit Laborwachsstreifen versiegeln. Um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten, lassen Sie das Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius rotieren. Am folgenden Tag fügen Sie der Gewebeextraktsuspension feste Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 1,2 Mol hinzu.
Gut mischen und Zentrifuge hatte 250.000 x g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in zwei Milliliter Homogenisierungspuffer mit 1,9 molaren Saccharose durch Verreitration resuspendiert und bei 125.000 x g 45 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach der Zentrifugation die oberste weiße feste Schicht in ein frisches Röhrchen überführen und einen Milliliter Eiskaltwaschpuffer durch mehrmaliges Auf- und Abstreichen lösen.
Da das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert ist, entsorgen Sie die wässrige Mittelschicht und kombinieren Sie das Pellet mit der obersten Schicht für eine höhere Ausbeute. Die kombinierten Fraktionen bei 8.000 x g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Eiskaltaufschlusspuffer und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für drei Stunden auf einem Wirbel.
Zentrifugieren Sie die Probe erneut, waschen Sie das Pellet dann zweimal in einem Milliliter eiskaltem Tris-Puffer und zentrigieren Sie erneut. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in einem Milliliter Solubilisierungspuffer durch Pipettieren auf und ab resuspendieren und das Röhrchen bei 200.000 x g für 60 Minuten bei vier Grad Celsius schnell zentrifugieren. Speichern Sie das Pellet und reduzieren Sie dann die Saccharosekonzentration von 1,3 auf einen Mol, indem Sie dem Überstand 50 millimolar Tris-Puffer hinzufügen.
Zentrifen Sie den Überstand erneut und lösen Sie dann beide Pellets und 100 Mikroliter Tris-Puffer mit 0,5% SDS auf. Zur Amyloidreinigung die amyloidreichen Pellets mit Ultraschallwellen in einem Badbeschallungsgerät für 20 Zyklen löseln und das Material dann sofort bei 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern 0,5% SDS Tris-Puffer und wiederholen Sie das Waschen vier weitere Male, Nach dem letzten Zentrifugationsschritt waschen Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Reinstwasser und zentrifugieren Sie 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um das verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen.
Lösen Sie das endgültige Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen in 100 Mikrolitern Reinstwasser auf. Die gereinigten 100 Mikroliter Amyloidfibrillen werden in 400 Mikrolitern Methanol und Wirbelgut gelöst. Dann 100 Mikroliter Chloroform und Wirbel noch einmal untermischen.
Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie gründlich vor. Nach der Zentrifugation bei 12.000 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur die oberste wässrige Schicht vorsichtig entfernen, ohne die Grenzschicht, die die Proteinflocke enthält, zu stören, und das gleiche Volumen Methanol erneut zugeben. Wiederholen Sie die Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft.
Für die Verdauung lösen Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Guanidinhydrochloridpuffer auf und beschallen Sie es in einem eiskalten Wasserbad. Dann gründlich für 45 Minuten bis eine Stunde bei Raumtemperatur vorwirbeln, 50 Mikroliter 0,2% Tensidlösung hinzufügen und erneut für weitere 60 Minuten vorwirbeln. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 500 Millimolar TCEP hinzu und inkubieren Sie für 60 Minuten.
Dann fügen Sie zwei Mikroliter 500 millimolar Jodacetamid hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln für 20 Minuten. Nach der Inkubation das Jodacetamid mit fünf Mikrolitern TCEP-Lösung für 15 Minuten abschrecken. Als nächstes fügen Sie das erforderliche Volumen von 50 Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung in das Röhrchen ein, um die Guanidinkonzentration auf 1,5 Mol zu reduzieren.
Fügen Sie auch 1% ige Tensidlösung in das Röhrchen hinzu. Dann Trypsin hinzufügen und die Röhre über Nacht bei 37 Grad Celsius mischen lassen. Am nächsten Tag fügen Sie Ameisensäure zu der verdauten Peptidlösung hinzu, um den pH-Wert auf 2,0 zu senken, aktivieren Sie dann die C18-Spinsäule, indem Sie 200 Mikroliter 50% Methanollösung hinzufügen und bei 1500 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur drehen.
Als nächstes gleichen Sie die C18-Säulenharzbetten aus, indem Sie 200 Mikroliter Gleichgewichtspuffer hinzufügen und sich zwei Minuten lang erneut drehen. Nach dem Ausgleich die angesäuerte Peptidlösung auf die C18-Säule geben und bei Raumtemperatur zwei Minuten lang bei 1500 x g zentrifugieren. Laden Sie den Durchfluss neu, drehen Sie die Säule, und verwerfen Sie den zweiten Durchfluss.
Dann waschen Sie die an das C18-Harz gebundenen Peptide zweimal mit dem Waschpuffer. Elutien Sie das Peptid dreimal, indem Sie 40 Mikroliter Elutionspuffer hinzufügen und die Säule zentrifugieren. Trocknen Sie die Peptide in einem Geschwindigkeits-Vakuumkonzentrator, indem Sie die wässrige Lösung verdampfen.
Die trockenen Pellets können vor der MS-Analyse einige Wochen bei 20 Grad Celsius gelagert werden. Die kongolesrote Färbung von gereinigten Amyloiden dokumentiert die Anreicherung der Amyloidfibrillen im Vergleich zur SDS-löslichen Fraktion. Die lösliche SDS-Fraktion zeigte nicht das Vorhandensein von Amyloiden.
Die Struktur der gereinigten Fibrillen bestätigte das Vorhandensein von fast reinen Amyloidfibrillen. Auch die Immungoldmarkierung bestätigte das Vorhandensein von Amyloid-beta-42-Peptiden. Die Färbung mit Anti-Amyloid-Beta-42- und Anti-Fibrillen-Antikörpern zeigte eine relative Häufigkeit von Amyloid-beta-42-Peptiden in Fibrillen.
Gereinigte Amyloidfraktionen zeigten das Vorhandensein von etwa 250 Proteinen, während die vor Ultraschall und SDS-Waschung gesammelte Fraktion mehr als 2.500 Proteine enthielt. Fibrillenkerne zeigten eine Anreicherung von Proteinen, die mit nichtmembrangebundenen Organellen und supramolekularen Komplexen assoziiert sind. Amyloide sind Arten mit geringer Häufigkeit, vielleicht ein paar Pikogramme bis wenige Mikrogramm pro Milligramm Hirngewebe.
Sie müssen also sehr vorsichtig sein, wenn Sie die Lagen, Paletten oder den Überstand abholen. Mit der Entwicklung dieser Technik können Sie nun Proteine, die mit den ursprünglichen Amyloidsamen assoziiert sind, sicherer identifizieren, ihre Struktur charakterisieren und sie für therapeutische Interventionen ansprechen. Daher wird der Ausbruch dieser tödlichen Krankheit verhindert.
