Placas amiloides são necessárias para o diagnóstico da doença de Alzheimer. No entanto, eles não são suficientes. Apesar disso, permanecem enigmáticos devido, em parte, a desafios na caracterização de seus conteúdos.
Nosso protocolo é altamente eficiente em isolar fibrilas amiloides em alta pureza e é adequado para entender os detalhes finos da estrutura e da composição. Conhecer o teor proteico das placas amiloides pode ajudar a identificar os alvos de intervenção terapêutica que podem retardar, interferir ou prevenir seu acúmulo. Portanto, atrasando o início da doença.
Este método é bem adequado para extrair depósitos de proteínas de tecidos cerebrais degenerados e agregados de proteínas em diferentes outras vias proteicas. Comece colocando uma região de tecido cerebral congelado recém-dissecada ou escamosa em um tubo de dois mililitros contendo seis a oito contas de cerâmica em um tampão de homogeneização fria recém-preparada. Em seguida, triture o tecido usando um homogeneizador de moinho de contas a 4.000 rpm com dois ciclos de 30 segundos dentro e fora do pulso.
Agora adicione nove mililitros de tampão de homogeneização fria ao um mililitro de homogeneização do tecido cerebral e um tubo de 15 mililitros e selo com tiras de filme de cera de laboratório. Para garantir a solubilização robusta, mantenha o tubo girando durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, adicione sacarose sólida à suspensão do extrato de tecido a uma concentração final de 1,2 mols.
Misture bem e centrífuga teve 250.000 x g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernascimento, resuspenque a pelota em dois mililitros de tampão de homogeneização contendo 1,9 sacarose molar por trituração e centrífuga a 125.000 x g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação transfira a camada sólida branca superior para um tubo fresco e solubilize um mililitro de tampão de lavagem gelada acariciando-se várias vezes.
Uma vez que a pelota também é enriquecida com fibrilas amiloides, descarte a camada média aquosa e combine a pelota com a camada superior para um rendimento maior. Centrifugar as frações combinadas a 8.000 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supernascimento, resuspenque a pelota em um mililitro de tampão de digestão gelada e incubar à temperatura ambiente por três horas em um vórtice.
Centrifugar a amostra novamente, em seguida, lavar a pelota duas vezes em um mililitro de tampão tris frio gelado e centrífuga novamente. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de solubilização por pipetar para cima e para baixo e centrifugar rapidamente o tubo a 200.000 x g por 60 minutos a quatro graus Celsius. Salve a pelota, depois reduza a concentração de sacarose de 1,3 para um molar adicionando 50 mililitros de tampão Tris ao supernatante.
Centrifugar o supernante novamente, em seguida, dissolver as duas pelotas e 100 microliters de tampão Tris contendo 0,5% SDS. Para purificação amiloide, solubilize as pelotas ricas em amiloides usando ondas de ultrassom em um dispositivo de sônica de banho por 20 ciclos, depois centrifugar imediatamente o material a 20.000 x g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenque a pelota em 500 microlitres de tampão SDS Tris de 0,5% e repita a lavagem mais quatro vezes, Após a etapa final de centrifugação, lave a pelota em 200 microlitradores de água ultrauso e centrífugue 20.000 x g por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover qualquer detergente restante.
Dissolva a última pelota contendo fibrilas amiloides purificadas em 100 microliters de água ultrapura. Dissolva os 100 microliters purificados de fibrilas amiloides em 400 microliters de metanol e vórtice bem. Em seguida, misture em 100 microliters de clorofórmio e vórtice novamente.
Em seguida, adicione 300 microliters de água ultrapura e vórtice completamente. Após a centrifugação a 12.000 x g por dois minutos em temperatura ambiente, remova cuidadosamente a camada superior aquosa sem perturbar a camada de interface contendo o floco de proteína e adicione novamente o mesmo volume de metanol. Repita a centrifugação, descarte o sobrenasce e seque a pelota.
Para digestão, dissolva a pelota em 50 microliters de tampão de cloridrato de guanidina e sonicato em um banho de água gelada. Em seguida, o vórtice completamente por 45 minutos a uma hora em temperatura ambiente, adicione 50 microliters de solução surfactante de 0,2% e vórtice novamente por mais 60 minutos. Em seguida, adicione um microliter de 500 milmolares DE TCEP e incubar por 60 minutos.
Em seguida, adicione dois microliters de iodoacetamida de 500 milimolares e incubar no escuro por 20 minutos. Após a incubação, sacie a iodoacetamida com cinco microliters de solução TCEP por 15 minutos. Em seguida, adicione o volume necessário de 50 milimônios solução de bicarbonato de amônio ao tubo para reduzir a concentração de guanidina para 1,5 mols.
Além disso, adicione 1% de solução surfactante ao tubo. Em seguida, adicione trippsina e deixe o tubo se misturando a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione ácido fórmico à solução de peptídeo digerido para baixar o pH para 2.0, em seguida, ative a coluna de giro C18 adicionando 200 microliters de solução de 50% metanol e girando a 1500 x g por dois minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, equilibre os leitos de resina da coluna C18 adicionando 200 microliters de tampão de equilíbrio e girando novamente por dois minutos. Após o equilíbrio, carregue a solução de peptídeo acidificado na coluna C18 e centrífuga a 1500 x g por dois minutos à temperatura ambiente. Recarregue o fluxo através, gire a coluna e descarte o segundo fluxo através.
Em seguida, lave os peptídeos ligados à resina C18 duas vezes com o tampão de lavagem. Elute o peptídeo três vezes adicionando 40 microliters de tampão de eluição e centrifugando a coluna. Seque os peptídeos em um concentrador de vácuo de velocidade evaporando a solução aquosa.
As pelotas secas podem ser salvas a 20 graus Celsius por algumas semanas antes da análise de MS. A coloração vermelha do Congo de amiloides purificados documenta o enriquecimento das fibrilas amiloides em comparação com a fração solúvel da SDS. A fração solúvel da SDS não mostrou a presença de amiloides.
A estrutura das fibrilas purificadas confirmou a presença de fibrilas amiloides quase puras. Além disso, a rotulagem de imunogold confirmou a presença de peptídeos beta-42 amiloides. As manchas usando anticorpos beta-42 anti-amilóides e anti-fibril mostraram uma abundância relativa de peptídeos beta-42 amiloides em fibrilas.
Frações amiloides purificadas mostraram a presença de aproximadamente 250 proteínas, enquanto a fração coletada antes da ultrassônica e lavagem de SDS continha mais de 2.500 proteínas. Os núcleos fibril apresentaram enriquecimento de proteínas associadas a organelas e complexos supramoleculares não ligados à memmbrana. Amiloides são espécies de baixa abundância, talvez alguns picogramas a poucos microgramas por miligramas de tecidos cerebrais.
Então você precisa ter muito cuidado ao pegar as camadas, paletes ou descartar o supernatante. Com o desenvolvimento dessa técnica, agora você pode identificar com mais confiança proteínas associadas às sementes amiloides iniciais, caracterizar sua estrutura e direcioná-las para intervenção terapêutica. Portanto, prevenindo o aparecimento desta doença mortal.
