アミロイドプラークは、アルツハイマー病の診断に必要です.しかし、それだけでは不十分です。この事実にもかかわらず、彼らは部分的に彼らの内容を特徴付ける際の課題のために謎めいたままです。
当社のプロトコルは、アミロイド線維を高純度で単離するのに非常に効率的であり、構造および組成の細部を理解するのに非常に適している。アミロイドプラークのタンパク質含有量を知ることは、それらの蓄積を遅らせ、妨害し、または防止する可能性のある治療介入の標的を特定するのに役立つ可能性がある。したがって、疾患発症を遅らせる。
この方法は、変性した脳組織からタンパク質沈着物を抽出するのによく適しており、異なる他のタンパク質経路におけるタンパク質凝集体である。まず、解剖またはスナップ凍結したばかりの脳組織領域を、新たに調製した氷冷均質化バッファーに6〜8個のセラミックビーズを含む2ミリリットルのチューブに入れます。次いで、ビーズミルホモジナイザーを用いて、30秒間のオンおよびオフパルスの2サイクルで4,000rpmで組織を粉砕する。
次に、1ミリリットルの脳組織ホモジネートと15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの氷冷ホモジナイゼーションバッファーを加え、実験室用ワックスフィルムストリップでシールします。堅牢な可溶化を確実にするために、チューブを摂氏4度で一晩回転させてください。翌日、固体スクロースを組織抽出物懸濁液に終濃度1.2モルとなるように添加する。
よく混合し、遠心分離機は摂氏4度で45分間250,000 x gであった。上清を捨てた後、ペレットを粉砕して1.9モルのスクロースを含む2ミリリットルの均質化緩衝液に再懸濁し、摂氏4度で125,000 x gで45分間遠心分離する。遠心分離後、上部の白色固体層を新鮮なチューブに移し、数回上下にふれあげて1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを可溶化する。
ペレットはまたアミロイド線維で富んでいるので、水性中間層を捨て、より高い収率のためにペレットを最上層と組み合わせる。結合画分を8, 000 x gで摂氏4度で20分間遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの氷冷消化バッファーに再懸濁し、ボルテックス上で室温で3時間インキュベートする。
試料を再度遠心分離し、次いでペレットを1ミリリットルの氷冷トリス緩衝液中で2回洗浄し、再度遠心分離する。2回目の洗浄後、ペレットを上下にピペッティングして1ミリリットルの可溶化バッファーに再懸濁し、チューブを摂氏4度で60分間200,000 x gで素早く遠心分離します。ペレットを保存し、次いで、上清に50ミリモルのトリス緩衝液を加えてスクロース濃度を1.3モルから1モルに減少させる。
上清を再び遠心分離し、次いで、0.5%SDSを含むペレットおよび100マイクロリットルのトリス緩衝液の両方を溶解する。アミロイド精製のために、浴中超音波処理装置中で超音波を使用してアミロイドが豊富なペレットを20サイクル可溶化し、次いで直ちに材料を20, 000 x gで4°Cで30分間遠心分離する。ペレットを500マイクロリットルの0.5%SDSトリス緩衝液に再懸濁し、洗浄をさらに4回繰り返し、最終遠心分離工程の後、ペレットを200マイクロリットルの超純水で洗浄し、20,000 x gを摂氏4度で30分間遠心分離して、残りの洗剤を除去した。
精製アミロイド線維を含む最終ペレットを100マイクロリットルの超純水に溶解する。精製された100マイクロリットルのアミロイド線維を400マイクロリットルのメタノールおよびボルテックスウェルに溶解する。その後、100マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを再び混ぜる。
次に、300マイクロリットルの超純水とボルテックスを徹底的に加えます。室温で12, 000 x gで2分間遠心分離した後、タンパク質フレークを含む界面層を乱すことなく上部の水層を注意深く除去し、同じ量のメタノールを再度加える。遠心分離を繰り返し、上清を捨て、ペレットを風乾する。
消化のために、ペレットを50マイクロリットルの塩酸グアニジン緩衝液に溶解し、氷冷水浴中で超音波処理する。次いで、室温で45分〜1時間十分にボルテックスし、50マイクロリットルの0.2%界面活性剤溶液を加え、さらに60分間ボルテックスを再度ボルテックスする。次に、1マイクロリットルの500ミリモルTCEPを加え、60分間インキュベートする。
次いで、2マイクロリットルの500ミリモルヨードアセトアミドを加え、暗所で20分間インキュベートする。インキュベーション後、ヨードアセトアミドを5マイクロリットルのTCEP溶液で15分間クエンチする。次に、必要量の50ミリモルの重炭酸アンモニウム溶液をチューブに加え、グアニジン濃度を1.5モルに減らす。
また、チューブに1%界面活性剤溶液を加える。その後、トリプシンを加え、チューブを摂氏37度で一晩混合したままにします。翌日、消化ペプチド溶液にギ酸を加えてpHを2.0に下げ、200マイクロリットルの50%メタノール溶液を加え、室温で1500 x gで2分間回転させてC18スピンカラムを活性化します。
次に、200マイクロリットルの平衡化バッファーを加えてC18カラム樹脂床を平衡化し、再度2分間紡糸する。平衡化後、酸性化ペプチド溶液をC18カラムにロードし、室温で1500 x gで2分間遠心分離します。フローをリロードし、カラムを回転させて、2 番目のフロースルーを破棄します。
次いで、C18樹脂に結合したペプチドを洗浄バッファーで2回洗浄する。40マイクロリットルの溶出バッファーを加え、カラムを遠心分離してペプチドを3回溶出する。水溶液を蒸発させることにより速度真空濃縮器でペプチドを乾燥させる。
乾燥ペレットは、MS分析の前に数週間摂氏20度で保存することができます。精製アミロイドのコンゴレッド染色は、SDS可溶性画分と比較したアミロイド線維の濃縮を文書化する。SDS可溶性画分にはアミロイドの存在は示さなかった。
精製された線維の構造は、ほぼ純粋なアミロイド線維の存在を確認した。また、イムノゴールド標識はアミロイドβ-42ペプチドの存在を確認した。抗アミロイドβ−42および抗フィブリル抗体を用いた染色は、フィブリル中のアミロイドβ−42ペプチドの相対的存在量を示した。
精製アミロイド画分は約250タンパク質の存在を示したが、超音波処理およびSDS洗浄前に収集された画分は2,500以上のタンパク質を含んでいた。フィブリルコアは、非膜結合オルガネラおよび超分子複合体に関連するタンパク質の濃縮を示した。アミロイドは存在量の少ない種であり、おそらく脳組織のミリグラムあたり数ピコグラムから数マイクログラムである。
したがって、層、パレットを拾うとき、または上澄み液を捨てるときは、非常に注意する必要があります。この技術の開発により、初期のアミロイド種子に関連するタンパク質をより自信を持って同定し、その構造を特徴付け、治療介入のためにそれらを標的とすることができるようになりました。したがって、この致命的な病気の発症を予防する。
