Les plaques amyloïdes sont nécessaires pour le diagnostic de la maladie d’Alzheimer. Cependant, ils ne sont pas suffisants. Malgré cela, ils restent énigmatiques en partie à cause des difficultés à caractériser leur contenu.
Notre protocole est très efficace pour isoler les fibrilles amyloïdes à haute pureté et est bien adapté pour comprendre les détails fins de la structure et de la composition. Connaître la teneur en protéines des plaques amyloïdes peut aider à identifier les cibles d’une intervention thérapeutique qui peuvent retarder, interférer ou empêcher leur accumulation. Par conséquent, retarder l’apparition de la maladie.
Cette méthode est bien adaptée à l’extraction de dépôts de protéines à partir de tissus cérébraux dégénérés et d’agrégats de protéines dans différentes autres voies protéiques. Commencez par placer une région de tissu cérébral fraîchement disséquée ou congelée dans un tube de deux millilitres contenant six à huit perles de céramique dans un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé. Ensuite, broyer le tissu à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes à 4 000 tr / min avec deux cycles de 30 secondes sur et hors impulsion.
Maintenant, ajoutez neuf millilitres de tampon d’homogénéisation glacé au millilitre d’homogénéat de tissu cérébral et un tube de 15 millilitres et un joint avec des bandes de film de cire de laboratoire. Pour assurer une solubilisation robuste, maintenez le tube en rotation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, ajouter du saccharose solide à la suspension d’extrait tissulaire à une concentration finale de 1,2 mole.
Mélangez bien et centrifugez 250 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille dans deux millilitres de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 saccharose molaire en triturant et centrifuger à 125 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, transférer la couche solide blanche supérieure dans un tube frais et solubiliser un millilitre de tampon de lavage à froid en caressant plusieurs fois.
Étant donné que la pastille est également enrichie en fibrilles amyloïdes, jetez la couche intermédiaire aqueuse et combinez la pastille avec la couche supérieure pour un rendement plus élevé. Centrifuger les fractions combinées à 8 000 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille dans un millilitre de tampon de digestion glacé et incubez à température ambiante pendant trois heures sur un vortex.
Centrifugez à nouveau l’échantillon, puis lavez la pastille deux fois dans un millilitre de tampon Tris glacé et centrifugez à nouveau. Après le deuxième lavage, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de solubilisation en pipetant de haut en bas et centrifugez rapidement le tube à 200 000 x g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius. Économisez la pastille, puis réduisez la concentration de saccharose de 1,3 à une molaire en ajoutant un tampon Tris de 50 millimolaires au surnageant.
Centrifugez à nouveau le surnageant, puis dissolvez les deux pastilles et 100 microlitres de tampon Tris contenant 0,5% de FDS. Pour la purification amyloïde, solubilisez les pastilles riches en amyloïde à l’aide d’ondes ultrasonores dans un dispositif de sonication de bain pendant 20 cycles, puis centrifugez immédiatement le matériau à 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Remettre la pastille dans 500 microlitres de tampon Tris à 0,5% SDS et répéter le lavage quatre fois de plus, Après l’étape finale de centrifugation, laver la pastille dans 200 microlitres d’eau ultrapure et centrifuger 20 000 x g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer tout détergent restant.
Dissoudre la pastille finale contenant des fibrilles amyloïdes purifiées dans 100 microlitres d’eau ultrapure. Dissoudre les 100 microlitres purifiés de fibrilles amyloïdes dans 400 microlitres de méthanol et bien vortex. Ensuite, mélangez à nouveau 100 microlitres de chloroforme et de vortex.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’eau ultrapure et de vortex à fond. Après centrifugation à 12 000 x g pendant deux minutes à température ambiante, retirer soigneusement la couche aqueuse supérieure sans perturber la couche d’interface contenant le flocon de protéine et ajouter à nouveau le même volume de méthanol. Répétez la centrifugation, jetez le surnageant et séchez la pastille à l’air.
Pour la digestion, dissoudre la pastille dans 50 microlitres de tampon de chlorhydrate de guanidine et sonicate dans un bain d’eau glacée. Ensuite, vortexez abondamment pendant 45 minutes à une heure à température ambiante, ajoutez 50 microlitres de solution de tensioactif à 0,2% et vortexez à nouveau pendant 60 minutes supplémentaires. Ensuite, ajoutez un microlitre de TCEP de 500 millimolaires et incubez pendant 60 minutes.
Ajoutez ensuite deux microlitres d’iodoacétamide de 500 millimolaires et incubez dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après l’incubation, tremper l’iodoacétamide avec cinq microlitres de solution de TCEP pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez le volume requis de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires au tube pour réduire la concentration de guanidine à 1,5 mole.
Ajoutez également une solution de tensioactif à 1% dans le tube. Ensuite, ajoutez la trypsine et laissez le tube mélanger à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez de l’acide formique à la solution peptidique digérée pour abaisser le pH à 2,0, puis activez la colonne de spin C18 en ajoutant 200 microlitres de solution de méthanol à 50% et en filant à 1500 x g pendant deux minutes à température ambiante.
Ensuite, équilibrez les lits de résine de colonne C18 en ajoutant 200 microlitres de tampon d’équilibrage et en tournant à nouveau pendant deux minutes. Après équilibrage, charger la solution peptidique acidifiée sur la colonne C18 et centrifuger à 1500 x g pendant deux minutes à température ambiante. Rechargez le flux à travers, faites tourner la colonne et jetez le deuxième flux à travers.
Ensuite, lavez les peptides liés à la résine C18 deux fois avec le tampon de lavage. Éluez le peptide trois fois en ajoutant 40 microlitres de tampon d’élution et en centrifugant la colonne. Sécher les peptides dans un concentrateur à vide rapide en évaporant la solution aqueuse.
Les granulés secs peuvent être conservés à 20 degrés Celsius pendant quelques semaines avant l’analyse de la SEP. La coloration rouge Congo des amyloïdes purifiées documente l’enrichissement des fibrilles amyloïdes par rapport à la fraction soluble SDS. La fraction soluble SDS n’a pas montré la présence d’amyloïdes.
La structure des fibrilles purifiées a confirmé la présence de fibrilles amyloïdes presque pures. En outre, le marquage immunogold a confirmé la présence de peptides bêta-42 amyloïdes. La coloration à l’aide d’anticorps anti-bêta-amyloïde bêta-42 et anti-fibrilles a montré une abondance relative de peptides bêta-42 amyloïdes dans les fibrilles.
Les fractions amyloïdes purifiées ont montré la présence d’environ 250 protéines, tandis que la fraction recueillie avant les ultrasons et le lavage SDS contenait plus de 2 500 protéines. Les noyaux de fibrilles ont montré un enrichissement en protéines associées à des organites non liés aux membranes et aux complexes supramoléculaires. Les amyloïdes sont des espèces de faible abondance, peut-être quelques picogrammes à quelques microgrammes par milligramme de tissus cérébraux.
Vous devez donc être très prudent lorsque vous ramassez les couches, les palettes ou jetez le surnageant. Avec le développement de cette technique, vous pouvez maintenant identifier avec plus de confiance les protéines associées aux graines amyloïdes initiales, caractériser leur structure et les cibler pour une intervention thérapeutique. Par conséquent, prévenir l’apparition de cette maladie mortelle.
