Наш протокол in situ имеет важное значение, поскольку он обеспечивает простой способ визуализации моделей экспрессии генов с минимальным фоном окрашивания. Этот метод делает сложный и длительный протокол относительно простым в работе. Бенчтоп создал предложения и контрольные списки, которые делают этот протокол еще проще для правильного выполнения и воспроизведения.
Хотя методы, показанные здесь, специфичны для Astyanax mexicanus, они, вероятно, могут быть адаптированы к другим системам лиц сопоставимого размера с небольшими корректировками протокола. Во-первых, используйте цветную лабораторную ленту для обозначения флаконов и пипеток для каждого гена. Используя пипетки Пастера, сортим эмбрионы.
Есть, как правило, не более 12 эмбрионов на флакон, после сортировки. Затем установите трясущимся водяной бане до 70 градусов по Цельсию. Тщательно вытянуть метанол во флаконах отсортированных эмбрионов и заменить его 500 микролитров свежего 100%-ного метанола.
Вымойте эмбрионы кратко в течение примерно одной минуты на платформе шейкер. После этого, регидратировать эмбрионы в возрастающей концентрации 1x PBS с Tween 20 на платформе шейкер, как указано в текстовом протоколе. Для начала поместите небольшую прокладку с сетчатым дном в вращающуюся водяную баню, которая была разогрета до 70 градусов по Цельсию.
Поместите алициты буфера гибридизации минус и буфер гибридизации плюс в прокладку. Аккуратно добавьте подготовленный раствор PK во флаконы эмбрионов, гарантируя, что все ткани полностью покрыты раствором. Перенесите флаконы на шейкер платформы и дайте им переварить в белковом растворе K рабочий раствор в течение примерно 12 минут.
После этого осторожно свяжте раствор ПК и кратко затопите флакон PBT, чтобы разбавить оставшийся ПК. Замените решение PBT на 500 микролитров свежего PBT и дайте раствору промыть на платформе шейкер в течение пяти минут. Затем замените решение PBT на 500 микролитров оттаяли 4%PFA. Пусть эмбрионы инкубируются на шейкере платформы при комнатной температуре в течение 20 минут.
Чтобы начать предгигигилитизацию, добавьте 500 микролитров довоенной гибридизации буфера минус раствор эмбрионсодержащих флаконов. Аккуратно поместите флаконы в прокладку в водяной бане при 70 градусах по Цельсию, не встряхивая в течение пяти минут. Далее свяжь буфер гибридизации минус раствор и затопит флаконы 500 микролитров довоенного буфера гибридизации плюс раствор.
Поместите флаконы обратно в прокладку в водяной бане и инкубировать с встряхивания либо в течение четырех часов или на ночь. Чтобы начать гибридизацию, вырисуйте буфер гибридизации плюс из флаконов и замените его 500 микролитров свежего довоенного буфера гибридизации плюс. Аккуратно добавьте два микролитров РНК-зонда к каждому флакону и аккуратно закружить, чтобы обеспечить равномерное распределение зонда.
Инкубировать в водяной бане при 70 градусах по Цельсию на ночь при встряхивании при 40 об/мин. Для начала подготовьте микроцентрифуговые трубки с пометкой буфер гибридизации плюс с геном интереса РНК-зонда, как указано в текстовом протоколе. Установите две 15-миллилитровые конические трубки и добавьте 0,2 грамма блокирующего реагента и 10 миллилитров MABT.
Поместите обе трубки на ореховый миксер до тех пор, пока реагент полностью не растворится в растворе. С помощью стеклянной пипетки Pasteur свяжте буфер гибридизации плюс и раствор зонда и поместите его в стерильную помеченную микроцентрифугную трубку. Храните эту трубку в морозильной камере при температуре минус 20 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.
Аккуратно добавьте 500 микролитров теплого солевого цитрата натрия и буфер гибридизации минус разбавления. Инкубировать в последовательных решений в течение 10 минут каждый в тряске водяной бане, а затем при комнатной температуре на платформе шейкер, как указано в текстовом протоколе. После последней инкубации замените 100%PBT с каждого флакона 500 микролитров MABT.
Повторите этот процесс дважды в течение пяти минут каждый. Во-первых, удалить MABT из каждого флакона и затопить его с предварительно смешанным блокирующим раствором из одной из 15-миллилитровых конических труб. Поместите оба флакона на ореховый миксер в течение четырех часов при комнатной температуре.
Добавьте два микролитров фрагментов антитела ко второй трубке подготовленного блокирующего раствора и кратко вихрю. Затем заполните каждый флакон почти полностью блокирующим раствором и поместите их на ореховый миксер на ночь в холодильнике при четырех градусах по Цельсию. Для начала подготовьте фондовый флакон 10%NGS в MABT.
Замените блокирующий раствор в каждом флаконе 500 микролитров этого решения NGS. Инкубировать при комнатной температуре на платформе шейкера в течение 25 минут. После этого замените смесь NGS на 500 микролитров 100%MABT.
Инкубировать на платформе шейкер при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторите это полоскание еще 11 раз в течение дня, каждые 30 минут. Затем заполните каждый флакон 100%MABT и поместите их на ореховый миксер на ночь в холодильнике при четырех градусах по Цельсию.
Во-первых, заменить MABT в каждом флаконе с одним миллилитров буфера AP и дайте ему мыть в течение пяти минут. Повторите эту стирку дважды, чтобы полностью удалить MABT. Затем замените буфер AP на один миллилитр свежего буфера AP, содержащий 3,5 микролитров BCIP и 4,5 микролитров MBT.
Замените это свежей смесью буфера AP, содержащего BCIP и MBT каждый час, пока реакция не будет завершена, убедившись, что контролировать реакцию внимательно и проверять каждые 15 минут, пока желаемый уровень окрашивания не был достигнут. Остановите реакцию окраски путем полоскания эмбрионов в растущей концентрации 1X PBT в буфере AP, как указано в протоколе. Промыть эмбрионы примерно в пяти миллилитров 100% PBT на ореховый смеситель до желаемого минимального фонового окрашивания не будет достигнуто.
Когда полоскания завершена, мыть эмбрионы в 500 микролитров стерильных PBS на платформе шейкер и postfix образцов, как указано в текстовом протоколе. После полоскания эмбрионов, поместите их в четыре миллилитров 100% стерильных PBS и при необходимости хранить их в долгосрочной перспективе на четыре градуса по Цельсию. В этом исследовании эмбриональные образцы астианакса помечены для высококачественного анализа экспрессии генов.
Этот процесс успешно внедрен как в пашон пещерных рыб, так и в эмбрионах поверхностных рыб. Эмбрионы cavefish, помеченные для экспрессии Sox9, демонстрируют четкую маркировку в развивающихся ветвях арок и грудного плавника. Обратите внимание, что окрашивание практически отсутствует в желтковом мешке или развивающихся somites на фланге.
Аналогичным образом, выражение Tfap2a проявляется в части развивающейся головы, как ранняя миграция нейронных клеток гребня вдоль спинного фланга области эмбриона. Третий ген, представленный для эмбрионов пещерных рыб, Phf20a, виден в порциях соматических мезодермов и задней головы, которые суждено привести к костлявой ткани. Поверхностные эмбрионы рыб, помеченные для CXCR, показывают положительную маркировку в изолированных областях головы и фланга, а также несколько отдельных клеток, облив желтковый мешок.
Ген Adcyap1a выражается в регионах центральной нервной системы, включая клетки гипофиза. Обратите внимание на высокоспецифическое выражение в парных двусторонних скоплениях клеток на спинной аспект эмбриона, а также большую область экспрессии средней линии. Последний ген, исследованный для эмбрионов пещерных рыб, Sox10, очевиден как ранний маркер нервного гребня на левой и правой сторонах спинного эмбриона.
После завершения на месте, мы обычно изображение наших результатов с помощью световой микроскопии. Лучше всего сделать это в течение двух недель после завершения, чтобы избежать деградации окрашивания.
