Этот протокол обеспечивает полезную клеточную модель для изучения функции и проницаемости селективных сосудистых барьеров, таких как гемато-ретинальный или гематоэнцефалический барьер с особым акцентом на эндотелиальный трансцитоз. Этот анализ прост в настройке и использовании, не требуя живых животных. Он может быть использован для исследования различных молекулярных регуляторов проницаемости эндотелиальных клеток и трансцитоза, влияющих на целостность внутреннего гемато-ретинального барьера.
Этот анализ может дать представление о сосудистой биологии и исследованиях глаз и мозга, позволяя лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе контроля BRB BBB, и изучить потенциальную доставку лекарств через барьеры. Для начала подготовьте вставки фильтра клеточной культуры для посева микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека или HRMECs, покрыв каждую вставку 200 микролитрами 0,1% раствора желатина в течение 30 минут под ламинарной вытяжкой. Убедитесь, что раствор покрывает всю нижнюю поверхность фильтрующей вставки.
Возьмите чашку Петри с культивированными HRMC, инкубированными при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, и аспирируйте питательную среду. Осторожно промойте клетки дважды 10 миллилитрами 1X PBS под ламинарным капотом потока, чтобы избавиться от потенциальных плавающих или мертвых клеток. Диссоциируют клетки 0,5-1 миллилитра 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и помещают чашку Петри в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 5 минут.
Погасите активность трипсина путем добавления от 4,5 до 9 миллилитров питательной среды и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку с помощью 10-миллилитровой пипетки. Раскрутите клетки в 200 раз в течение 5 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 3 миллилитрах питательной среды.
Подсчитайте количество клеток с помощью ручного гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и посейте семена при плотности 40 000 клеток на вставку фильтра. Объем клеточной суспензии для каждой вставки составляет 250 микролитров. Аспирируют раствор покрытия из скважин, содержащих проницаемые вставки, и переносят 250 микролитров клеточной суспензии на вставку, затем добавляют только среду к одной из вставок, которая будет использоваться в качестве холостого контроля для измерения трансэндотелиального электрического сопротивления, или TEER.
Одновременно добавляют также 750 микролитров среды на скважину в базолатеральные камеры. Держите 24-луночную пластину с проницаемыми вставками в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 7-12 дней, пока культивируемые клетки не станут полностью сливающимися и не будет достигнуто желаемое значение TEER около 20 Ом на квадратный сантиметр. Перед измерениями TEER поместите ячейку, содержащую 24 скважины, в ламинарную вытяжку при комнатной температуре на 15-20 минут для выравнивания температуры.
Чтобы измерить TEER для HRMC, используя систему электрического сопротивления эпителиального вольт/Омметра, подключите электрод к измерителю и уравновешивайте электрод, сначала замачивая его в 70% этаноле в течение 15-20 минут, а затем ненадолго погружая его в среду роста EGM клеточной культуры. Выполните измерение TEER, тщательно погружая электрод, так что более короткий наконечник находится во вставке, а более длинный наконечник касается дна колодца. Сначала измерьте сопротивление по заготовительному элементу управления, а затем для каждой вставки измерьте TEER в трех экземплярах.
Достигнув слияния со значениями TEER около 20 Ом квадратных сантиметров, сыворотка лишает клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, используя 0,5% FBS в EBM в обеих камерах до обработки лигандом. Сывороточно-восстановленный EBM использовался на протяжении всего анализа. Инкубируют клетки с использованием сывороточно-восстановленной среды в апикальной камере с флуоресцентным цианин-3-меткой до трансферрина-лиганда в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия.
После промывки монослоя апически и базолатерально 4 раза сывороточно-восстановленной средой добавляют свежую среду в фильтрующие вставки, содержащие клетки, и переносят вставки в свежие колодцы 24-луночной пластины, содержащей предварительно выровненную сывороточно-восстановленную среду. Инкубируйте клетки еще 90 минут в инкубаторе, а затем соберите среду из базолатеральной камеры. Запишите интенсивность флуоресценции раствора из базолатеральной камеры с помощью флуоресцентного детектора.
Достигнув слияния со значениями TEER около 20 Ом квадратных сантиметров, сыворотка лишает клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, используя 0,5% FBS в EBM в обеих камерах до обработки лигандом. Сывороточно-восстановленный EBM использовался на протяжении всего анализа. Затем обработайте клетки в апикальной камере желаемыми методами обработки и контроля транспортного средства.
Добавьте в клетки 5 миллиграммов на миллилитр пероксидазы хрена, или HRP, и инкубируйте в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Добавьте свежую сывороточную среду в апикальную камеру и переложите вставки в свежий колодец, содержащий предварительно обработанные среды. Высиживайте монослой в течение дополнительных 90 минут в инкубаторе.
После сбора среды из базолатеральной камеры добавляют в собранную среду 100 микролитров фторогенного пероксидазного субстрата HRP и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Остановите реакцию 100 микролитрами стоп-раствора и определите уровни продукта реакции подложки HRP в среде с помощью флуоресцентного пластинчатого считывателя. Перед демонстрацией анализов трансцитоза in vitro визуализация трансцитоза эндотелиальных клеток в сетчатке показана в качестве справочной информации.
Здесь изображение светового микроскопа показывает заполненный HRP просвет кровеносных сосудов от 3-месячного участка сетчатки мыши дикого типа, окрашенного DAB. HRP был ретро-орбитально введен. Заполненные HRP сосуды сетчатки можно увидеть как темно-коричневый осадок под световым микроскопом.
Просвечивающий электронный микроскоп ультратонкий срез показывает заполненные HRP трансцитотические сосуды с RMEC, изображающими трансцитоз EC через внутренний гемато-ретинальный барьер. Здесь большой пузырь потенциально отражает макропиносомы и эритроциты на стороне люминола. Изображение TeM показывает заполненные HRP небольшие трансцитотические везикулы, вероятно, везикулы caveola, в пределах RMEC.
Иммуногистохимическое окрашивание антител CAV-1 и изолектина B4 демонстрирует локализацию CAV-1, маркера везикул каверолы в кровеносных сосудах сетчатки, в 3-месячной сетчатке мыши дикого типа. Изображение TeM меченого иммунозолотым CAV-1 в эндотелиальных клетках сетчатки показано здесь с увеличенным изображением ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО Везикулы кавеолы CAV-1. Для анализа трансцитоза EC-опосредованного клатрином в HRMC с использованием трансферрина, здесь изображение флуоресцентного микроскопа показывает эндоцитозированный трансферрин Cy3 красного цвета в HRMC, окрашенных DAPI в синем цвете.
Для кавеол-опосредованного EC трансцитоза с использованием HRP в качестве примера для демонстрации анализа используется сигнализация Wnt. Недавно было обнаружено, что сигнализация Wnt регулирует трансцитоз ЭК, опосредованный кавеолами. Клетки обрабатывали активатором пути Wnt Wnt средой, обусловленной Wnt3a, и рекомбинантным Норрином, с или без сигнального ингибитора Wnt XAV939 и их реактивных контролей.
Активаторы Wnt снижали уровень трансцитоза на основе HRP, который был обращен вспять XAV939. Правильное измерение TEER имеет решающее значение для определения целостности монослоя. На него сильно влияют различные факторы, такие как неправильное обращение, колебания температуры, культуральная среда, продолжительность культуры и т. Д.
Этот анализ может быть модифицирован как кокультура или 3D-органотипические системы культур, имитирующие условия in vivo.
