Расширение генетического кода, или GCE, преодолевает ограничения других стратегий маркировки. Это позволяет нам размещать специально меченые белки, и у нас есть яркие органические флуорофоры, которые позволяют их визуализировать, поэтому мы можем избежать стратегий, которые производят, скажем, флуоресцентные слияния белков, которые могут нарушить функцию белка. Этот метод может быть применен к любой другой системе.
Например, мы использовали его для маркировки белка Zika CO, и это позволяет нам предоставлять и производить меченый вирус Зика, который мы затем можем наблюдать, заражая клетки-хозяева. Для начала переведите 100 микролитров первичной культуры в пять миллилитров среды LB, содержащей 35 микрограммов на миллилитр левомицетина и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 об/мин, пока оптическая плотность при 600 нанометрах не достигнет 0,6.
Замените среду LB модифицированной N-минимальной средой, дополненной одним миллимолярным TCO, неканонической аминокислотой. И выращивайте бактерии при температуре 34 градуса по Цельсию в течение 30 минут. Добавьте 0,2% арабинозы, 25 миллиграммов на миллилитр хлорамфеникола и 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина и выращивайте клетки еще шесть часов, встряхивая при 250 об/мин.
Через шесть часов промойте бактерии четыре раза с интервалом в 30 минут свежими средами MgM без неканонических аминокислот или ncAA. Центрифугируйте бактерии, повторно суспендируйте в буфере PBS и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в темноте, чтобы удалить излишки ncAA. Через час центрифугируйте бактерии при температуре 3 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и храните их для дальнейшего использования.
Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, экспрессируя белки, несущие ncAA, в отсутствие ncAA. Повторно суспендировать клетки сальмонеллы, экспрессирующие SseJ, инкорпорированные с TCO в отсутствие или присутствие TCO в PBS. Отрегулируйте оптическую плотность на 600 нанометрах до четырех в PBS и инкубируйте клетки с 20-микромолярным тетразеном Janelia Fluor 646 или 20-микромолярным тетразином BDPFL при 37 градусах Цельсия в темноте и встряхивайте в течение одного-двух часов при 250 об/мин.
Гранулируйте ячейки и промойте три-четыре раза PBS, содержащим 5% DMSO и 0,2% Pluronic F-127. Повторно суспендируйте гранулы в PBS, содержащем 5% ДМСО. После инкубации в течение ночи при четырех градусах Цельсия в темноте еще раз дважды промыть PBS.
Немедленно визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа или зафиксируйте их 1,5% параформальдегидом в PBS в течение 30-45 минут при комнатной температуре в темноте. Культивируйте и поддерживайте клетки HeLa при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности 95% в DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS в дополнение к пенициллину стрептомицину. Культивируют бактерии за день до заражения и инокулируют одну колонию сальмонеллы дикого типа, содержащую плазмиду pEVOL, содержащую ортогональную пару тРНК-синтетазы, и плазмиду pWSK29, содержащую ген SseJ, в пять миллиметров антибиотика, содержащего стандартный бульон LB, в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 об / мин.
Восстановите разбавленный клеточный запас со скоростью 100 000 клеток на миллилитр и засейте 50 000 клеток HeLA на лунку в 500 микролитров DMEM, содержащего 10% питательной среды FBS, в восьмилуночном горном горке. Храните предметное стекло в инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 95% влажности. Для бактериальной инфекции субкультуру сальмонеллы дикого типа, содержащую плазмиду pEVOL и плазмиду pWSK29, содержащую ген SseJ, путем разбавления 100 микролитров ночной бактериальной культуры в три миллилитра среды LB, содержащей 35 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина.
Инкубировать при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин в течение пяти-семи часов. Чтобы инициировать инфекцию клеток HeLa, после извлечения клеток HeLa из инкубатора промойте клетки предварительно подогретым DPBS и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров свежего DMEM, содержащего 10% FBS. Поместите горку камеры обратно в инкубатор с углекислым газом, пока не начнется заражение.
После пяти-семи часов инкубации разбавьте культуру сальмонеллы так, чтобы оптическая плотность на 600 нанометрах составляла 0,2 в одном миллилитре питательной среды DMEM, и добавьте необходимое количество инокулята сальмонеллы в каждую лунку предметного стекла камеры, чтобы кратность инфекции составляла 100. После инкубации инфицированных клеток в инкубаторе с углекислым газом в течение 30 минут трижды промойте клетки предварительно подогретым DPBS для удаления внеклеточной сальмонеллы. Установите этот момент времени на ноль часов после заражения и добавьте 500 микролитров полной среды, содержащей 100 микрограммов на миллилитр гентамицина в течение одного часа.
После инкубации снова трижды промойте клетки DPBS, как показано ранее, и добавьте 500 микролитров полной среды с добавлением 0,2% арабинозы, 10 микрограммов на миллилитр гентамицина в каждую лунку предметного стекла камеры. В контрольном эксперименте выполняйте аналогичные инфекции клеток HeLa без TCO. После инкубации предметного стекла камеры в течение 10 часов в инкубаторе углекислого газа замените всю среду свежей полной средой без совокупной стоимости владения и промойте клетки HeLa четыре раза с интервалом в 30 минут каждая предварительно подогретым DPBS.
Затем промойте клетки свежей полной средой без совокупной стоимости владения. Через 12 часов после заражения аспирируйте среду из клеток и промойте клетку предварительно подогретым DPBS два или три раза. В одну группу лунок добавляют 500 микролитров смеси раствора красителя один, а в другую группу лунок того же горного стекла камеры добавляют 500 микролитров смеси раствора красителя два.
Поместите камеру обратно в инкубатор с углекислым газом на один и от 1/2 до двух часов. Через 13,5-14 часов после заражения дважды промойте клетки HeLa предварительно подогретым DPBS и добавьте 500 микролитров свежего DMEM с добавлением FBS. После инкубации в течение 30 минут снова промойте клетки предварительно подогретым DPBS, как показано ранее, а затем промойте свежим DMEM четыре раза с интервалом в 30 минут.
Через 16 часов после заражения зафиксируйте клетки HeLa параформальдегидом, добавив 200 микролитров 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Аспирируйте параформальдегид. Трижды промойте PBS и храните клетки в PBS при четырех градусах Цельсия в темноте.
Поднесите клетки к микроскопу и поместите камеру визуализации на столик микроскопа в держателе образца. Затем замените среду в лунке на 0,4 миллилитра свежеприготовленного буфера для визуализации GLOX BME. Уменьшите мощность лазера примерно до одного милливатта, чтобы идентифицировать интересующую ячейку HeLa, и отрегулируйте фокальную плоскость и угол лазерного луча, освещая образец низкой плотностью лазера 647 нанометров.
Отрегулируйте угол освещения HILO. Захватите эталонное изображение целевой структуры с ограниченной дробью и переключите флуорофоры в темное состояние, повернув лазер на максимальную мощность. Установите коэффициент усиления предварительного усилителя на три и активируйте передачу кадров.
Затем установите усиление ЭМ на 200 для более высокой чувствительности при измерениях dSTORM. Отрегулируйте мощность лазера до подходящего уровня, при котором мигающие события разделены в пространстве и времени. Установите время экспозиции на 30 миллисекунд и начните съемку.
Приобретайте от 10 000 до 30 000 кадров. Повторите аналогичное приобретение с разной рентабельностью инвестиций. Для восстановления изображений dSTORM откройте изображение J и импортируйте необработанные данные.
Откройте плагин Thunderstorm и настройте параметры камеры, соответствующие устройству. Перейдите к запуску анализа и установите соответствующие настройки, такие как фильтрация изображений, методы локализации и субпиксельная локализация молекул. Нажмите кнопку «ОК», чтобы начать реконструкцию изображения и начать анализ конечных результатов постобработки.
Сальмонеллы, экспрессирующие SseJ, включенные в TCO, обрабатывают тетразином Janelia Fluor 646 и визуализируют флуоресценцией Janelia Fluor 646 в отсутствие или присутствие TCO. Флуоресценция SseJ обнаруживается только при наличии TCO. Клетки HeLa инфицируются сальмонеллой, содержащей psseJ-HA в течение 16 часов, фиксируются и иммуноокрашиваются антителами против HA, LPS и DAPI.
Как и ожидалось, в инфицированных клетках образуются SseJ-зависимые филаменты, индуцированные сальмонеллой, или SIF. При отсутствии TCO янтарный кодон не подавляется, а SseJ-зависимые SIF отсутствуют в инфицированных клетках HeLa. SseJ-зависимые SIF наблюдаются в присутствии TCO, что ясно указывает на то, что SseJ был спасен экспрессией SseJF10TCOHA с использованием расширения генетического кода или GCE.
Здесь показана специфичность маркировки секретируемого SseJF10TCOHA в клетках HeLa с помощью клик-реакций SPIEDAC с использованием двух альтернативных смесей красителей один и смеси красителей два. Клик-краситель Janelia Fluor 646 TZ был дополнительно использован для наблюдения за тем, есть ли какая-либо фоновая маркировка в клетках HeLa, инфицированных сальманеллой дикого типа, несущей SseJ HA, в присутствии плазмиды TCO и P. SseJ высвобождался в цитоплазму клетки-хозяина без внутриклеточных или неспецифических флуоресцентных сигналов, демонстрирующих, что флуоресцентный сигнал был специфичен для SseJ.
На этом рисунке представлена визуализация со сверхвысоким разрешением меченого SseJ GCE в клетках HeLa. Здесь показано изображение наблюдаемой клетки HeLa в светлом поле. Здесь представлено дифракционное ограниченное широкопольное изображение секретируемого SseJ, меченного TCO и Janelia Fluor 646, и соответствующее изображение dSTORM украшенных SseJ SIF.
На вставке показано увеличенное изображение SseJ со сверхразрешением в коробочной области. Биржевые решения NCAA были подготовлены в NaOH. Не забывайте нейтрализовать его до или после добавления в носитель.
После мечения интересующего белка тщательно промойте клетку, чтобы фоновый сигнал был минимальным. Следуя нашей процедуре GCE, теперь мы можем маркировать любой фактор вирулентности бактерий и следить за его активностью, используя наши методы визуализации.
