A expansão do código genético, ou GCE, supera as limitações de outras estratégias de rotulagem. Isso nos permite localizar proteínas especificamente marcadas, e temos fluoróforos orgânicos brilhantes que permitem sua visualização, para que possamos evitar estratégias que façam, digamos, fusões de proteínas fluorescentes, que podem interromper a função da proteína. Este método pode ser aplicado a qualquer outro sistema.
Por exemplo, nós o usamos para rotular a proteína Zika CO, e isso nos permite fornecer e produzir o vírus Zika rotulado que podemos observar infectando células hospedeiras. Para começar, transfira 100 microlitros de cultura primária para cinco mililitros de meio LB contendo 35 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,6.
Substitua o meio LB pelo meio N-mínimo modificado suplementado com um TCO milimolar, um aminoácido não canônico. E crescer as bactérias a 34 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 0,2% de arabinose, 25 miligramas por mililitro de cloranfenicol e 100 miligramas por mililitro de ampicilina e cultive as células por mais seis horas, agitando a 250 RPM.
Após seis horas, lavar as bactérias quatro vezes em um intervalo de 30 minutos com meios frescos de MgM sem aminoácidos não canônicos ou, ncAA. Centrifugar as bactérias, ressuspender em tampão PBS e incubar por uma hora a quatro graus Celsius no escuro para remover o excesso de ncAAs. Após uma hora, centrifugar as bactérias a 3.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius e armazená-las para uso posterior.
Para um experimento controle, repita o mesmo experimento expressando proteínas portadoras de ncAA na ausência de ncAA. Ressuspender células de salmonela que expressam SseJ incorporado com TCO na ausência ou presença de TCO em PBS. Ajustar a densidade óptica em 600 nanômetros a quatro em PBS e incubar as células com 20 micromolares Janelia Fluor 646 tetrazeno ou 20 micromolares BDPFL tetrazina a 37 graus Celsius no escuro, e agitar por uma a duas horas a 250 RPM.
Pastilha as células e lavagem três a quatro vezes com PBS contendo 5% de DMSO e 0,2% de Pluronic F-127. Ressuspender o pellet em PBS contendo DMSO a 5%. Depois de incubar durante a noite a quatro graus Celsius no escuro, lave duas vezes novamente com PBS.
Fotografe as células imediatamente usando um microscópio confocal ou fixe-as com paraformaldeído a 1,5% em PBS por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. Cultivar e manter células HeLa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade em DMEM de alta glicose suplementado com 10% de FBS, além de penicilina estreptomicina. Cultivar bactérias um dia antes da infecção e inocular uma única colônia de salmonela selvagem contendo plasmídeo pEVOL contendo par de tRNA sintetase ortogonal e plasmídeo pWSK29 contendo o gene SseJ em cinco milímetros de antibiótico contendo caldo LB padrão durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM.
Reparar um estoque de células diluídas a 100.000 células por mililitro e sementes de 50.000 células HeLA por poço em 500 microlitros de DMEM contendo meio de crescimento 10%FBS em uma lâmina de câmara de oito poços. Mantenha a lâmina da câmara em uma incubadora por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Para a infecção bacteriana, subcultura de salmonela selvagem contendo plasmídeo pEVOL e plasmídeo pWSK29 contendo o gene SseJ, diluindo 100 microlitros de cultura bacteriana noturna em três mililitros de meio LB contendo 35 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 100 microgramas por mililitro de ampicilina.
Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por cinco a sete horas. Para iniciar a infecção celular HeLa, depois de retirar as células HeLa da incubadora, lave as células com DPBS pré-aquecido e adicione 500 microlitros de DMEM fresco contendo 10% FBS a cada poço. Coloque a lâmina da câmara de volta na incubadora de dióxido de carbono até que a infecção comece.
Após cinco a sete horas de incubação, diluir a cultura de salmonela de modo que a densidade óptica a 600 nanômetros seja de 0,2 em um mililitro de meio de crescimento DMEM e adicionar as quantidades necessárias do inóculo de salmonela a cada poço da lâmina da câmara, de modo que a multiplicidade de infecção seja de 100. Depois de incubar as células infectadas em uma incubadora de dióxido de carbono por 30 minutos, lave as células três vezes com DPBS pré-aquecido para remover salmonela extracelular. Defina este ponto de tempo para zero horas pós-infecção e adicione 500 microlitros de meio completo contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina por uma hora.
Após a incubação, novamente, lavar as células três vezes com DPBS como mostrado anteriormente e adicionar 500 microlitros do meio completo suplementado com 0,2% de arabinose, 10 microgramas por mililitro de gentamicina em cada poço da lâmina da câmara. Em um experimento controle, realizar infecções semelhantes de células HeLa sem TCO. Depois de incubar a lâmina da câmara por 10 horas na incubadora de dióxido de carbono, substitua o meio completo por meio completo fresco sem TCO e lave as células HeLa quatro vezes em um intervalo de 30 minutos cada com DPBS pré-aquecido.
Em seguida, lave as células com meio fresco completo sem TCO. Após 12 horas pós-infecção, aspirar o meio das células e lavá-lo com DPBS pré-aquecido duas ou três vezes. Em um grupo dos poços, adicione 500 microlitros da mistura de solução de corante um, e em outro grupo dos poços da mesma lâmina de câmara, adicione 500 microlitros da mistura de solução de corante dois.
Coloque a câmara desliza de volta para a incubadora de dióxido de carbono por uma e 1/2 a duas horas. Após 13,5 a 14 horas pós-infecção, lave as células HeLa duas vezes com DPBS pré-aquecido e adicione 500 microlitros de DMEM fresco suplementado com FBS. Depois de incubar por 30 minutos, lave as células novamente com DPBS pré-aquecido, como mostrado anteriormente, e depois lave com DMEM fresco quatro vezes em um intervalo de 30 minutos.
Às 16 horas pós-infecção, fixar as células HeLa com paraformaldeído adicionando 200 microlitros de paraformaldeído a 4% em cada poço e incubando por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Aspirar o paraformaldeído. Enxaguar três vezes com PBS e armazenar as células em PBS a quatro graus Celsius no escuro.
Leve as células ao microscópio e coloque a câmara de imagem no palco do microscópio no suporte da amostra. Em seguida, troque o meio no poço com 0,4 mililitros do tampão de imagem GLOX BME recém-feito. Diminua a potência do laser para cerca de um miliwatt para identificar uma célula HeLa de interesse e ajuste o plano focal e o ângulo do feixe de laser enquanto ilumina a amostra com baixas densidades de laser de 647 nanômetros.
Ajuste o ângulo de iluminação HILO. Capture uma referência à imagem limitada por fração da estrutura alvo e alterne os fluoróforos para o estado escuro girando o laser para sua potência máxima. Ajuste o ganho do pré-amplificador para três e ative a transferência de quadros.
Em seguida, defina o ganho de EM para 200 para maior sensibilidade nas medições de dSTORM. Ajuste a intensidade do laser para um nível adequado onde os eventos de piscar são separados no espaço e no tempo. Defina o tempo de exposição para 30 milissegundos e inicie a aquisição.
Adquira de 10.000 a 30.000 quadros. Repita a aquisição semelhante em ROIs diferentes. Para a reconstrução de imagens do dSTORM, abra a imagem J e importe os dados brutos.
Abra o plug-in Thunderstorm e defina a configuração da câmera correspondente ao dispositivo. Vá para executar a análise e defina as configurações apropriadas, como filtragem de imagem, métodos de localização e localização de subpixels de moléculas. Clique em OK para iniciar a reconstrução da imagem e iniciar a análise do resultado final pós-processamento.
Salmonella expressando SseJ incorporada com TCO são tratadas com Janelia Fluor 646 tetrazina e imageadas com fluorescência Janelia Fluor 646 na ausência ou presença de TCO. A fluorescência do SseJ é detectada apenas quando o TCO está presente. As células HeLa são infectadas com salmonela contendo psseJ-HA por 16 horas, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti HA, LPS e DAPI.
Como esperado, filamentos induzidos por salmonela dependentes de SseJ, ou SIFs, são formados nas células infectadas. Na ausência de TCO, o códon âmbar não é suprimido, e SIFs dependentes de SseJ estão ausentes em células HeLa infectadas. SIFs dependentes de SseJ são observados na presença de TCO, o que indica claramente que SseJ foi resgatado pela expressão de SseJF10TCOHA usando expansão de código genético, ou GCE.
A especificidade de marcação de SseJF10TCOHA secretado em células HeLa através de reações de clique SPIEDAC usando duas misturas de corantes alternativos um e dois são mostrados aqui. O corante Click Janelia Fluor 646 TZ foi ainda usado para observar se havia alguma marcação de fundo em células HeLa infectadas com Salmanella selvagem portando SseJ HA na presença de TCO e plasmídeo de abóbada P. SseJ foi liberado no citoplasma da célula hospedeira sem sinais fluorescentes intracelulares ou inespecíficos, demonstrando que o sinal fluorescente era específico para SseJ.
Imagem de superresolução de ECG marcada com SseJ em células HeLa é apresentada nesta figura. Uma imagem de campo brilhante de uma célula HeLa sob observação é mostrada aqui. A imagem de campo largo limitado por difração de SseJ secretado rotulado com TCO e Janelia Fluor 646 e a imagem dSTORM correspondente dos SIFs decorados com SseJ são apresentados aqui.
A inserção mostra uma visão ampliada de um SseJ super resolvido na região da caixa. As soluções de estoque da NCAA foram preparadas em NaOH. Não se esqueça de neutralizá-lo antes ou depois da adição à mídia.
Depois de marcar a proteína de interesse, lave a célula extensivamente, para que o sinal de fundo seja mínimo. Seguindo nosso procedimento de ECG, agora, podemos rotular qualquer fator de virulência em bactérias e acompanhar sua atividade usando nossas técnicas de imagem.
