L’expansion du code génétique, ou ECM, surmonte les limites des autres stratégies d’étiquetage. Cela nous permet de localiser des protéines spécifiquement marquées, et nous avons des fluorophores organiques brillants qui permettent leur visualisation, de sorte que nous pouvons éviter les stratégies qui font, par exemple, des fusions de protéines fluorescentes, ce qui peut perturber la fonction des protéines. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel autre système.
Par exemple, nous l’avons utilisé pour marquer la protéine Zika CO, ce qui nous permet de fournir et de produire le virus Zika marqué que nous pouvons ensuite observer infecter les cellules hôtes. Pour commencer, transférez 100 microlitres de culture primaire dans cinq millilitres de milieu LB contenant 35 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 RPM jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,6.
Remplacer le milieu LB par le milieu N-minimal modifié complété par un TCO millimolaire, un acide aminé non canonique. Et cultivez les bactéries à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter 0,2% d’arabinose, 25 milligrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline, et faire croître les cellules pendant six heures supplémentaires, en agitant à 250 RPM.
Après six heures, laver les bactéries quatre fois sur un intervalle de 30 minutes avec un milieu MgM frais sans acides aminés non canoniques ou, ncAA. Centrifuger les bactéries, les remettre en suspension dans un tampon PBS et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour éliminer l’excès de ncAA. Après une heure, centrifuger les bactéries à 3 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et les stocker pour une utilisation ultérieure.
Pour une expérience de contrôle, répétez la même expérience en exprimant des protéines contenant des ncAA en l’absence de ncAA. Resuspendre les cellules de salmonelles exprimant SseJ incorporées avec le TCO en l’absence ou la présence de TCO dans le PBS. Ajustez la densité optique à 600 nanomètres à quatre dans PBS, et incuber les cellules avec 20 micromolaires Janelia Fluor 646 tétrazène ou 20 micromolaires BDPFL tétrazine à 37 degrés Celsius dans l’obscurité, et agiter pendant une à deux heures à 250 RPM.
Ensemencez les cellules et lavez trois à quatre fois avec du PBS contenant 5 % de DMSO et 0,2 % de F-127 pluronique. Remettez en suspension la pastille dans du PBS contenant 5 % de DMSO. Après avoir incubé pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité, laver deux fois de plus avec du PBS.
Imagez immédiatement les cellules à l’aide d’un microscope confocal, ou fixez-les avec 1,5% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 30 à 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Cultiver et maintenir les cellules HeLa à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité dans du DMEM à haute teneur en glucose complété par 10% FBS en plus de la streptomycine à pénicilline. Cultivez des bactéries un jour avant l’infection et inoculez une seule colonie de salmonelles de type sauvage hébergeant un plasmide pEVOL contenant une paire orthogonale d’ARNt synthétase et un plasmide pWSK29 contenant le gène SseJ dans cinq millimètres d’antibiotique contenant un bouillon LB standard pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 RPM.
Réparer un stock de cellules diluées à 100 000 cellules par millilitre et ensemencer 50 000 cellules HeLA par puits dans 500 microlitres de DMEM contenant 10% de milieu de croissance FBS dans une lame de chambre de huit puits. Gardez la glissière de la chambre dans un incubateur pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Pour l’infection bactérienne, sous-culture de salmonelles de type sauvage hébergeant le plasmide pEVOL et le plasmide pWSK29 contenant le gène SseJ en diluant 100 microlitres de culture bactérienne de nuit dans trois millilitres de milieu LB contenant 35 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
Incuber à 37 degrés Celsius en agitant à 250 tr / min pendant cinq à sept heures. Pour initier l’infection des cellules HeLa, après avoir retiré les cellules HeLa de l’incubateur, lavez les cellules avec du DPBS préchauffé et ajoutez 500 microlitres de DMEM frais contenant 10% de FBS à chaque puits. Replacez la glissière de la chambre dans l’incubateur de dioxyde de carbone jusqu’à ce que l’infection commence.
Après cinq à sept heures d’incubation, diluer la culture de salmonelles de sorte que la densité optique à 600 nanomètres soit de 0,2 dans un millilitre de milieu de croissance DMEM et ajouter les quantités requises d’inoculum de salmonelle à chaque puits de la lame de chambre, de sorte que la multiplicité de l’infection soit de 100. Après avoir incubé les cellules infectées dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, lavez les cellules trois fois avec du DPBS préchauffé pour éliminer les salmonelles extracellulaires. Réglez ce point de temps à zéro heure après l’infection et ajoutez 500 microlitres de milieu complet contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamicine pendant une heure.
Après l’incubation, lavez à nouveau les cellules trois fois avec DPBS comme indiqué précédemment et ajoutez 500 microlitres du milieu complet supplémenté avec 0,2% d’arabinose, 10 microgrammes par millilitre de gentamicine à chaque puits de la lame de chambre. Dans une expérience de contrôle, effectuer des infections similaires de cellules HeLa sans TCO. Après avoir incubé la lame de chambre pendant 10 heures dans l’incubateur de dioxyde de carbone, remplacez le milieu complet par un milieu complet frais sans TCO et lavez les cellules HeLa quatre fois sur un intervalle de 30 minutes chacune avec du DPBS préchauffé.
Ensuite, lavez les cellules avec un milieu complet frais sans TCO. Après 12 heures après l’infection, aspirer le milieu des cellules et laver la cellule avec du DPBS préchauffé deux ou trois fois. Dans un groupe de puits, ajouter 500 microlitres du mélange de solution de colorant un, et dans un autre groupe de puits de la même lame de chambre, ajouter 500 microlitres du mélange de solution de colorant deux.
Placez la chambre glisser dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant une heure et 1/2 à deux heures. Après 13,5 à 14 heures après l’infection, rincer les cellules HeLa deux fois avec du DPBS préchauffé et ajouter 500 microlitres de DMEM frais complété par FBS. Après avoir incubé pendant 30 minutes, laver à nouveau les cellules avec du DPBS préchauffé comme indiqué précédemment, puis laver avec du DMEM frais quatre fois sur un intervalle de 30 minutes.
16 heures après l’infection, fixer les cellules HeLa avec du paraformaldéhyde en ajoutant 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Aspirer le paraformaldéhyde. Rincer trois fois avec du PBS et stocker les cellules dans du PBS à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Amenez les cellules au microscope et placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope dans le porte-échantillon. Changez ensuite le milieu dans le puits avec 0,4 millilitre du tampon d’imagerie GLOX BME fraîchement fabriqué. Réduisez la puissance laser à environ un milliwatt pour identifier une cellule HeLa d’intérêt et ajuster le plan focal et l’angle du faisceau laser tout en éclairant l’échantillon avec de faibles densités laser de 647 nanomètres.
Ajustez l’angle d’éclairage HILO. Capturez une référence à une image à fraction limitée de la structure cible et passez les fluorophores à l’état sombre en tournant le laser à sa puissance maximale. Réglez le gain du préamplificateur sur trois et activez le transfert d’images.
Réglez ensuite le gain EM sur 200 pour une sensibilité plus élevée dans les mesures dSTORM. Ajustez la force du laser à un niveau approprié où les événements clignotants sont séparés dans l’espace et le temps. Réglez le temps d’exposition sur 30 millisecondes et commencez l’acquisition.
Acquérir 10 000 à 30 000 cadres. Répétez l’acquisition similaire à différents retours sur investissement. Pour la reconstruction d’images de dSTORM, ouvrez l’image J et importez les données brutes.
Ouvrez le plugin Thunderstorm et configurez le paramètre de caméra correspondant à l’appareil. Accédez à Exécuter l’analyse et définissez les paramètres appropriés, tels que le filtrage d’image, les méthodes de localisation et la localisation des molécules par sous-pixels. Cliquez sur OK pour démarrer la reconstruction de l’image et commencer l’analyse du résultat final post-traitement.
Les salmonelles exprimant SseJ incorporées avec TCO sont traitées avec Janelia Fluor 646 tétrazine et imagées avec Janelia Fluor 646 fluorescence en l’absence ou en présence de TCO. La fluorescence de SseJ n’est détectée que lorsque le TCO est présent. Les cellules HeLa sont infectées par des salmonelles hébergeant le psseJ-HA pendant 16 heures, fixées et immunocolorées avec des anticorps anti-HA, du LPS et du DAPI.
Comme prévu, des filaments induits par la salmonelle dépendants de SseJ, ou SIF, sont formés dans les cellules infectées. En l’absence de TCO, le codon ambre n’est pas supprimé et les SIF dépendants de SseJ sont absents dans les cellules HeLa infectées. Des SIF dépendants de SseJ sont observés en présence de TCO, ce qui indique clairement que SseJ a été sauvé par l’expression de SseJF10TCOHA en utilisant l’expansion du code génétique, ou GCE.
La spécificité du marquage du SseJF10TCOHA sécrété dans les cellules HeLa par le biais de réactions de clic SPIEDAC utilisant deux mélanges de colorants alternatifs un et deux mélanges de colorants sont présentés ici. Le colorant à clic Janelia Fluor 646 TZ a également été utilisé pour observer s’il y avait un marquage de fond dans les cellules HeLa infectées par Salmanella de type sauvage porteur de SseJ HA en présence de plasmide de la voûte TCO et P. SseJ a été libéré dans le cytoplasme de la cellule hôte sans signaux fluorescents intracellulaires ou non spécifiques démontrant que le signal fluorescent était spécifique à SseJ.
L’imagerie à super résolution de SseJ marqués GCE dans les cellules HeLa est présentée dans cette figure. Une image en fond clair d’une cellule HeLa sous observation est montrée ici. L’image à grand champ limité par diffraction de SseJ sécrété étiqueté avec TCO et Janelia Fluor 646 et l’image dSTORM correspondante des SIF décorés SseJ sont présentées ici.
L’encart montre une vue agrandie d’un SseJ super résolu dans la région de la boîte. Les solutions de stock NCAA ont été préparées en NaOH. N’oubliez pas de le neutraliser avant ou après l’ajout au support.
Après avoir marqué la protéine d’intérêt, lavez la cellule abondamment, de sorte que le signal de fond soit minimal. En suivant notre procédure CME, nous pouvons maintenant marquer n’importe quel facteur de virulence dans les bactéries et suivre son activité à l’aide de nos techniques d’imagerie.
