Die genetische Codeerweiterung (GCE) überwindet die Einschränkungen anderer Markierungsstrategien. Es ermöglicht uns, spezifisch markierte Proteine zu lokalisieren, und wir haben helle organische Fluorophore, die ihre Visualisierung ermöglichen, so dass wir Strategien vermeiden können, die beispielsweise fluoreszierende Proteinfusionen bewirken, die die Proteinfunktion stören können. Diese Methode kann auf jedes andere System angewendet werden.
Wir haben es zum Beispiel verwendet, um das Zika-CO-Protein zu markieren, und das ermöglicht es uns, markierte Zika-Viren bereitzustellen und zu produzieren, die wir dann bei der Infektion von Wirtszellen beobachten können. Zu Beginn werden 100 Mikroliter Primärkultur in fünf Milliliter LB-Medium mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin überführt. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 U/min, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht.
Ersetzen Sie das LB-Medium durch das modifizierte N-Minimal-Medium, das mit einer millimolaren TCO, einer nicht-kanonischen Aminosäure, ergänzt wird. Und lassen Sie die Bakterien 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius wachsen. Fügen Sie 0,2 % Arabinose, 25 Milligramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin hinzu und lassen Sie die Zellen weitere sechs Stunden lang bei 250 U/min züchten.
Waschen Sie die Bakterien nach sechs Stunden viermal in einem Intervall von 30 Minuten mit frischem MgM-Medium ohne nicht-kanonische Aminosäuren oder ncAA. Zentrifugieren Sie die Bakterien, suspendieren Sie sie erneut in PBS-Puffer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um überschüssige ncAAs zu entfernen. Nach einer Stunde zentrifugieren Sie die Bakterien bei 3.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und lagern sie für die weitere Verwendung.
Für ein Kontrollexperiment wiederholen Sie das gleiche Experiment, indem Sie ncAA-tragende Proteine in Abwesenheit von ncAA exprimieren. Resuspendierung von Salmonellenzellen, die SseJ exprimieren, das mit TCO inkorporiert ist, wenn TCO in PBS fehlt oder vorhanden ist. Stellen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern auf vier in PBS ein und inkubieren Sie die Zellen mit 20 mikromolaren Janelia Fluor 646-Tetrazen oder 20 mikromolaren BDPFL-Tetrazin bei 37 Grad Celsius im Dunkeln und schütteln Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei 250 U/min.
Die Zellen pelletieren und drei- bis viermal mit PBS waschen, das 5 % DMSO und 0,2 % Pluronic F-127 enthält. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS, das 5 % DMSO enthält. Nach der Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln zweimal mit PBS waschen.
Nehmen Sie die Zellen sofort mit einem konfokalen Mikroskop auf oder fixieren Sie sie mit 1,5 % Paraformaldehyd in PBS für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Kultivieren und pflegen Sie HeLa-Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit in DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS zusätzlich zu Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie Bakterien einen Tag vor der Infektion und inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von Wildtyp-Salmonellen mit einem pEVOL-Plasmid, das ein orthogonales tRNA-Synthetase-Paar und ein pWSK29-Plasmid mit SseJ-Gen enthält, in fünf Millimetern antibiotikahaltiger Standard-LB-Brühe über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min.
Reparieren Sie einen verdünnten Zellbestand mit 100.000 Zellen pro Milliliter und säen Sie 50.000 HeLA-Zellen pro Well in 500 Mikroliter DMEM, das 10 % FBS-Wachstumsmedium enthält, in einen Objektträger mit acht Wells. Bewahren Sie den Kammerschlitten 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit auf. Für die bakterielle Infektion werden Wildtyp-Salmonellen mit pEVOL-Plasmid und pWSK29-Plasmid, die das SseJ-Gen enthalten, subkultiviert, indem 100 Mikroliter Bakterienkultur über Nacht in drei Milliliter LB-Medium mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verdünnt werden.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 U/min für fünf bis sieben Stunden. Um die HeLa-Zellinfektion einzuleiten, waschen Sie die Zellen nach der Entnahme der HeLa-Zellen aus dem Inkubator mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie 500 Mikroliter frisches DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung. Legen Sie den Kammerschieber wieder in den Kohlendioxid-Inkubator, bis die Infektion beginnt.
Nach fünf bis sieben Stunden Inkubationszeit verdünnen Sie die Salmonellenkultur so, dass die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,2 in einem Milliliter DMEM-Nährmedium beträgt, und geben Sie die erforderlichen Mengen des Salmonellen-Inokulums in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers, so dass die Multiplizität der Infektion 100 beträgt. Nachdem Sie die infizierten Zellen 30 Minuten lang in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert haben, waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgewärmtem DPBS, um extrazelluläre Salmonellen zu entfernen. Stellen Sie diesen Zeitpunkt auf null Stunden nach der Infektion und fügen Sie eine Stunde lang 500 Mikroliter komplettes Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin hinzu.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation erneut dreimal mit DPBS, wie zuvor gezeigt, und geben Sie 500 Mikroliter des vollständigen Mediums, ergänzt mit 0,2 % Arabinose, 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin, in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers. Führen Sie in einem Kontrollexperiment ähnliche Infektionen von HeLa-Zellen ohne TCO durch. Nach 10-stündiger Inkubation des Kammerobjektträgers im Kohlendioxid-Inkubator wird das komplette Medium durch frisches Komplettmedium ohne TCO ersetzt und die HeLa-Zellen viermal im Abstand von jeweils 30 Minuten mit vorgewärmtem DPBS gewaschen.
Waschen Sie dann die Zellen mit frischem Komplettmedium ohne TCO. Nach 12 Stunden nach der Infektion saugen Sie das Medium von den Zellen ab und waschen Sie die Zelle zwei- bis dreimal mit vorgewärmtem DPBS. In eine Gruppe der Vertiefungen geben Sie 500 Mikroliter der Farbstofflösungsmischung eins hinzu, und in eine andere Gruppe der Vertiefungen desselben Kammerschiebers fügen Sie 500 Mikroliter der Farbstofflösungsmischung zwei hinzu.
Legen Sie die Kammerobjektträger für ein und 1/2 bis zwei Stunden zurück in den Kohlendioxid-Inkubator. Nach 13,5 bis 14 Stunden nach der Infektion werden die HeLa-Zellen zweimal mit vorgewärmtem DPBS gespült und 500 Mikroliter frisches DMEM, ergänzt mit FBS, hinzugefügt. Waschen Sie die Zellen nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten erneut mit vorgewärmtem DPBS, wie zuvor gezeigt, und waschen Sie sie dann viermal im Abstand von 30 Minuten mit frischem DMEM.
Fixieren Sie die HeLa-Zellen 16 Stunden nach der Infektion mit Paraformaldehyd, indem Sie 200 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in jede Vertiefung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Das Paraformaldehyd absaugen. Spülen Sie dreimal mit PBS und lagern Sie die Zellen in PBS bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Bringen Sie die Zellen zum Mikroskop und platzieren Sie die Bildgebungskammer auf dem Mikroskoptisch im Probenhalter. Wechseln Sie dann das Medium in der Vertiefung mit 0,4 Millilitern des frisch hergestellten GLOX BME-Bildverarbeitungspuffers. Verringern Sie die Laserleistung auf etwa ein Milliwatt, um eine HeLa-Zelle von Interesse zu identifizieren, und passen Sie die Fokusebene und den Laserstrahlwinkel an, während Sie die Probe mit niedrigen Laserdichten von 647 Nanometern beleuchten.
Passen Sie den HILO-Beleuchtungswinkel an. Nehmen Sie ein referenziertes und fraktionsbegrenztes Bild der Zielstruktur auf und schalten Sie die Fluorophore in den dunklen Zustand, indem Sie den Laser auf seine maximale Leistung drehen. Stellen Sie die Verstärkung des Vorverstärkers auf drei und aktivieren Sie die Bildübertragung.
Stellen Sie dann die EM-Verstärkung auf 200 ein, um eine höhere Empfindlichkeit bei dSTORM-Messungen zu erzielen. Stellen Sie die Laserstärke auf ein geeignetes Niveau ein, bei dem Blinkereignisse räumlich und zeitlich getrennt sind. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden ein und beginnen Sie mit der Aufnahme.
Erfassen Sie 10.000 bis 30.000 Frames. Wiederholen Sie die ähnliche Erfassung mit unterschiedlichen ROIs. Öffnen Sie für die Bilddatenrekonstruktion von dSTORM Bild J und importieren Sie die Rohdaten.
Öffnen Sie das Thunderstorm-Plugin und konfigurieren Sie die Kameraeinstellung, die dem Gerät entspricht. Wechseln Sie zu Analyse ausführen und legen Sie die entsprechenden Einstellungen fest, z. B. Bildfilterung, Lokalisierungsmethoden und Subpixellokalisierung von Molekülen. Klicken Sie auf OK, um die Bildrekonstruktion zu starten und die Endergebnisanalyse der Nachbearbeitung zu starten.
Salmonellen, die SseJ exprimieren und mit TCO inkorporiert sind, werden mit Janelia Fluor 646 Tetrazin behandelt und mit Janelia Fluor 646 Fluoreszenz in Abwesenheit oder Vorhandensein von TCO abgebildet. Die Fluoreszenz von SseJ wird nur detektiert, wenn TCO vorhanden ist. HeLa-Zellen werden 16 Stunden lang mit Salmonellen infiziert, die psseJ-HA beherbergen, fixiert und mit Anti-HA-Antikörpern, LPS und DAPI immungefärbt.
Erwartungsgemäß werden in den infizierten Zellen SseJ-abhängige Salmonellen-induzierte Filamente, kurz SIFs, gebildet. In Abwesenheit von TCO wird das bernsteinfarbene Codon nicht unterdrückt, und SseJ-abhängige SIFs fehlen in infizierten HeLa-Zellen. SseJ-abhängige SIFs werden in Gegenwart von TCO beobachtet, was eindeutig darauf hindeutet, dass SseJ durch die Expression von SseJF10TCOHA mittels genetischer Code-Expansion (GCE) gerettet wurde.
Die Markierungsspezifität von sezerniertem SseJF10TCOHA in HeLa-Zellen durch SPIEDAC-Click-Reaktionen unter Verwendung von zwei alternativen Farbstoffmischungen eins und Farbstoffmischungen zwei wird hier gezeigt. Der Click-Farbstoff Janelia Fluor 646 TZ wurde weiterhin verwendet, um zu beobachten, ob es in HeLa-Zellen, die mit Wildtyp-Salmanella infiziert waren, die SseJ HA trugen, in Gegenwart von TCO- und P-Tresorplasmid eine Hintergrundmarkierung gab. SseJ wurde in das Zytoplasma der Wirtszelle freigesetzt, ohne intrazelluläre oder unspezifische Fluoreszenzsignale, was darauf hindeutet, dass das Fluoreszenzsignal spezifisch für SseJ ist.
Die hochauflösende Bildgebung von GCE-markiertem SseJ in HeLa-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt. Eine Hellfeldaufnahme einer HeLa-Zelle unter Beobachtung ist hier zu sehen. Das beugungsbegrenzte Weitfeldbild von sekretiertem SseJ, markiert mit TCO und Janelia Fluor 646, und das entsprechende dSTORM-Bild der SseJ-dekorierten SIFs werden hier vorgestellt.
Das Insert zeigt eine vergrößerte Ansicht eines superaufgelösten SseJ im Boxed-Bereich. NCAA-Stammlösungen wurden in NaOH vorbereitet. Vergessen Sie nicht, es vor oder nach der Zugabe zum Medium zu neutralisieren.
Nachdem Sie das gewünschte Protein markiert haben, waschen Sie die Zelle ausgiebig, so dass das Hintergrundsignal minimal ist. Nach unserem GCE-Verfahren können wir nun jeden Virulenzfaktor in Bakterien markieren und seine Aktivität mit unseren bildgebenden Verfahren verfolgen.
