L'espansione del codice genetico, o GCE, supera i limiti di altre strategie di etichettatura. Ci consente di localizzare proteine specificamente etichettate e abbiamo fluorofori organici luminosi che consentono la loro visualizzazione, in modo da evitare strategie che producono, ad esempio, fusioni proteiche fluorescenti, che possono interrompere la funzione proteica. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi altro sistema.
Ad esempio, lo abbiamo usato per etichettare la proteina Zika CO e questo ci consente di fornire e produrre virus Zika etichettato che possiamo quindi osservare infettare le cellule ospiti. Per iniziare, trasferire 100 microlitri di coltura primaria in cinque millilitri di mezzo LB contenente 35 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 RPM fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6.
Sostituire il mezzo LB con il mezzo N-minimo modificato integrato con un TCO millimolare, un amminoacido non canonico. E fai crescere i batteri a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 0,2% arabinosio, 25 milligrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 milligrammi per millilitro di ampicillina e far crescere le cellule per altre sei ore, agitando a 250 giri / min.
Dopo sei ore, lavare i batteri quattro volte in un intervallo di 30 minuti con mezzi freschi di MgM senza aminoacidi non canonici o, ncAA. Centrifugare i batteri, risospendere nel tampone PBS e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius al buio per rimuovere gli ncAA in eccesso. Dopo un'ora, centrifugare i batteri a 3.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservarli per un ulteriore utilizzo.
Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento esprimendo le proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA. Risospendere le cellule di salmonella che esprimono SseJ incorporato con TCO in assenza o presenza di TCO nella PBS. Regolare la densità ottica a 600 nanometri a quattro in PBS e incubare le cellule con 20 micromolari Janelia Fluor 646 tetrazene o 20 micromolari BDPFL tetrazine a 37 gradi Celsius al buio e agitare per una o due ore a 250 RPM.
Pellet le cellule e lavarle tre o quattro volte con PBS contenente il 5% di DMSO e lo 0,2% di Pluronic F-127. Risospendere il pellet in PBS contenente il 5% di DMSO. Dopo aver incubato durante la notte a quattro gradi Celsius al buio, lavare due volte di nuovo con PBS.
Immagina immediatamente le cellule usando un microscopio confocale o fissale con paraformaldeide all'1,5% in PBS per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio. Coltivare e mantenere le cellule HeLa a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità in DMEM ad alto glucosio integrato con 10% FBS oltre alla streptomicina penicillina. Batteri di coltura un giorno prima dell'infezione e inoculare una singola colonia di salmonella wild-type che ospita plasmide pEVOL contenente coppia di tRNA sintetasi ortogonale e plasmide pWSK29 contenente gene SseJ in cinque millimetri di antibiotico contenente brodo LB standard durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 RPM.
Riparare uno stock di cellule diluite a 100.000 cellule per millilitro e seminare 50.000 cellule HeLA per pozzetto in 500 microlitri di DMEM contenente il 10% di terreno di crescita FBS in un vetrino a otto pozzetti. Tenere lo scorrimento della camera in un'incubatrice per 24 ore a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 95% umidità. Per l'infezione batterica, la sottocoltura di salmonella wild-type che ospita plasmide pEVOL e plasmide pWSK29 contenente il gene SseJ diluendo 100 microlitri di coltura batterica durante la notte in tre millilitri di terreno LB contenente 35 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.
Incubare a 37 gradi Celsius agitando a 250 RPM per cinque-sette ore. Per iniziare l'infezione delle cellule HeLa, dopo aver estratto le cellule HeLa dall'incubatore, lavare le cellule con DPBS preriscaldato e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco contenente il 10% di FBS a ciascun pozzetto. Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore ad anidride carbonica fino all'inizio dell'infezione.
Dopo cinque-sette ore di incubazione, diluire la coltura di salmonella in modo che la densità ottica a 600 nanometri sia 0,2 in un millilitro di terreno di crescita DMEM e aggiungere le quantità necessarie di inoculo di salmonella a ciascun pozzetto del vetrino della camera, in modo che la molteplicità dell'infezione sia 100. Dopo aver incubato le cellule infette in un incubatore ad anidride carbonica per 30 minuti, lavare le cellule tre volte con DPBS preriscaldato per rimuovere la salmonella extracellulare. Impostare questo punto temporale a zero ore dopo l'infezione e aggiungere 500 microlitri di terreno completo contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per un'ora.
Dopo l'incubazione, di nuovo, lavare le cellule tre volte con DPBS come mostrato in precedenza e aggiungere 500 microlitri del mezzo completo integrato con 0,2% arabinosio, 10 microgrammi per millilitro di gentamicina a ciascun pozzetto del vetrino della camera. In un esperimento di controllo, eseguire infezioni simili di cellule HeLa senza TCO. Dopo aver incubato il vetrino della camera per 10 ore nell'incubatore ad anidride carbonica, sostituire il mezzo completo con un mezzo completo fresco senza TCO e lavare le celle HeLa quattro volte nell'arco di 30 minuti ciascuna con DPBS preriscaldato.
Quindi lavare le celle con mezzo completo fresco senza TCO. Dopo 12 ore dall'infezione, aspirare il mezzo dalle cellule e lavare la cellula con DPBS preriscaldato due o tre volte. In un gruppo di pozzetti, aggiungere 500 microlitri della miscela di soluzione colorante uno, e in un altro gruppo di pozzetti della stessa vetrina, aggiungere 500 microlitri della miscela di soluzione colorante due.
Posizionare la camera di nuovo nell'incubatore ad anidride carbonica per una e mezza a due ore. Dopo 13,5-14 ore dopo l'infezione, sciacquare le cellule HeLa due volte con DPBS preriscaldato e aggiungere 500 microlitri di DMEM fresco integrato con FBS. Dopo l'incubazione per 30 minuti, lavare nuovamente le cellule con DPBS preriscaldato come mostrato in precedenza, quindi lavare con DMEM fresco quattro volte nell'arco di 30 minuti.
A 16 ore dopo l'infezione, fissare le cellule HeLa con paraformaldeide aggiungendo 200 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aspirare la paraformaldeide. Risciacquare tre volte con PBS e conservare le cellule in PBS a quattro gradi Celsius al buio.
Portare le cellule al microscopio e posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio nel supporto del campione. Quindi cambiare il mezzo nel pozzetto con 0,4 millilitri del tampone di imaging GLOX BME appena fatto. Ridurre la potenza del laser a circa un milliwatt per identificare una cella HeLa di interesse e regolare il piano focale e l'angolo del raggio laser illuminando il campione con basse densità laser a 647 nanometri.
Regolare l'angolo di illuminazione HILO. Cattura un riferimento all'immagine limitata della frazione della struttura target e passa i fluorofori allo stato scuro ruotando il laser alla sua massima potenza. Impostare il guadagno del preamplificatore su tre e attivare il trasferimento del fotogramma.
Quindi impostare il guadagno EM su 200 per una maggiore sensibilità nelle misurazioni dSTORM. Regolare la potenza del laser a un livello adeguato in cui gli eventi lampeggianti sono separati nello spazio e nel tempo. Impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi e iniziare l'acquisizione.
Acquisisci da 10.000 a 30.000 fotogrammi. Ripeti l'acquisizione simile con ROI diversi. Per la ricostruzione delle immagini di dSTORM, apri l'immagine J e importa i dati grezzi.
Apri il plug-in Thunderstorm e configura l'impostazione della fotocamera corrispondente al dispositivo. Vai a eseguire l'analisi e impostare le impostazioni appropriate, come il filtro delle immagini, i metodi di localizzazione e la localizzazione subpixel delle molecole. Fare clic su OK per avviare la ricostruzione dell'immagine e iniziare l'analisi del risultato finale di post-elaborazione.
Le Salmonelle che esprimono SseJ incorporate nel TCO sono trattate con Janelia Fluor 646 tetrazina e riprodotte con fluorescenza Janelia Fluor 646 in assenza o presenza di TCO. La fluorescenza di SseJ viene rilevata solo quando è presente il TCO. Le cellule HeLa sono infettate da salmonella che ospita psseJ-HA per 16 ore, fisse e immunocolorate con anticorpi anti HA, LPS e DAPI.
Come previsto, i filamenti indotti da salmonella SseJ, o SIF, si formano nelle cellule infette. In assenza di TCO, il codone ambrato non viene soppresso e i SIF dipendenti da SseJ sono assenti nelle cellule HeLa infette. I SIF dipendenti da SseJ sono osservati in presenza di TCO, il che indica chiaramente che SseJ è stato salvato dall'espressione di SseJF10TCOHA usando l'espansione del codice genetico, o GCE.
Qui è mostrata la specificità di etichettatura di SseJF10TCOHA secreto nelle cellule HeLa attraverso reazioni di clic SPIEDAC utilizzando due miscele di coloranti alternate una e una miscela di colorante due. Il colorante Click Janelia Fluor 646 TZ è stato ulteriormente utilizzato per osservare se vi fosse un'etichettatura di fondo nelle cellule HeLa infettate da Salmanella wild-type che trasportano SseJ HA in presenza di TCO e plasmide P vault. SseJ è stato rilasciato nel citoplasma della cellula ospite senza segnali fluorescenti intracellulari o non specifici, dimostrando che il segnale fluorescente era specifico per SseJ.
L'imaging ad altissima risoluzione della GCE marcata SseJ nelle cellule HeLa è presentato in questa figura. Un'immagine in campo chiaro di una cellula HeLa sotto osservazione è mostrata qui. L'immagine a campo largo limitato alla diffrazione di SseJ secreto etichettato con TCO e Janelia Fluor 646 e la corrispondente immagine dSTORM dei SIF decorati con SseJ sono presentati qui.
L'inserto mostra una vista ingrandita di un SseJ super risolto nella regione riquadro. Le soluzioni stock NCAA sono state preparate in NaOH. Non dimenticare di neutralizzarlo prima o dopo l'aggiunta ai supporti.
Dopo aver etichettato la proteina di interesse, lavare ampiamente la cellula, in modo che il segnale di fondo sia minimo. Seguendo la nostra procedura GCE, ora possiamo etichettare qualsiasi fattore di virulenza nei batteri e seguirne l'attività utilizzando le nostre tecniche di imaging.
