Авторы особенно признательны Дебора Харрис и Даниэль Маккей. Поддержка эта работа была предоставлена ​​биологический факультет и колледж искусств и наук CWRU, и HHMI номер гранта 52005866 на поддержку высшее образование в области биологических наук.

1. Методология изображений <ol><li> Растопить желе глицерина в 55 ° C степень водяной бане в течение 20-30 минут, пока она не станет однородной жидкости. Swirl, но не трясите бутылку, чтобы избежать образования пузырьков. </li><li> В то время как желе расплавов, нанесите тонкий слой глицерина использованием Kimwipe на чистую предметное стекло (опционально). </li><li> Внесите 1 до 1,5 мл расплавленного глицерин желе с помощью пипетки сократить P1000 наконечник на поверхность слайд, чтобы создать тонкий первый слой. Внесите тщательно, чтобы избежать пузырей. </li><li> Пусть желе укрепить в течение 5 мин на горизонтальной поверхности, затем поместить слайд при температуре -20 ° С в течение 5 мин и приступить к эмбрион выравнивания. Кроме того, крышка слайд с Саран Wrap и поместить его на 4 ° С в течение 5 дней. </li><li> Внесите небольшую каплю окрашенных эмбрионов в 70% глицерине / PBS или другими antifade на основе глицерина монтажа средств массовой информации (например, Slowfade или Vectashield) на стороне кровати желе. </li><li> Начало предварительно выравнивания эмбрионов индивидуально переводя их из выпадающего на поверхность желе. Передача их с помощью наклонной иглы для подкожных инъекций, использованием наклонной стороне ложки. </li><li> Грубо место эмбрионов вдоль 2 до 3 колонки. Если эмбрион застревает в иглу, размешайте его в раскрывающемся содержащие других эмбрионов, чтобы освободить его. Не тратьте время тщательно выравнивая их в этой точке. Оставьте немного пространства между колоннами. </li><li> Совместите эмбрионов, сдвинув их по горизонтали на среду желе с помощью шприца. Хотя раздвижные, ориентироваться головы и хвосты в том же направлении. Сделать их параллельно друг другу вдоль колонны. Удалите излишки глицерина PBS слева, как тропа с кусок витой Kimiwipe. Примечание: Превышение глицерина вызовет эмбрионы должны быть свободно заключенная в гель, в результате разделения двух слоев желе, что затрудняет резать и монтировать. И наоборот, удаляя слишком много глицерина будет сухой и придавить эмбрионов. </li><li> Используйте сократить желтый наконечник распространяться тонкий слой желе над эмбрионами (50-150 мкл, в зависимости от того, сколько были приведены в соответствие). </li><li> Место слайда в морозильной камере -20 ° С в течение 10-20 мин или хранить его при температуре 4 ° С в течение ночи. Убедитесь в том, желе полностью жесткой перед сокращением. В противном случае блок эмбрионов будет очень трудно акциза. Наилучшие результаты для резки получены на следующий день. </li><li> Под рассекает области, следует использовать лезвие, чтобы вырезать полностью через желе с обеих сторон выравниваются эмбрионов. Держите лезвие на 90 градусов, чтобы сделать прямые пропилы. Сокращения должны быть сделаны в непосредственной близости от переднего и заднего полюса эмбрионов, чтобы избежать избыточного желе, которые могут препятствовать визуализации. </li><li> Добавить 100-200 мкл холодного PBT (4 ° С, PBS, 0,1% Твин-20) рядом с порезами и аккуратно соскоблить желе между эмбрионами с помощью шпателя. Примечание: моющее средство в PBT помогает удаление желе из слайдов без повреждения эмбрионов. </li><li> Использование иглу, передача блока желе со встроенным эмбрионов на чистую слайд для дальнейшей резки. Вырезать мелкие блоки с 5-7 эмбрионов. Используйте PBT легко перемещать вокруг блока желе. Кроме того, место блока на сухую поверхность стекла, чтобы позволить этому придают стекла, что создает большую устойчивость именно для отделки желе, если это необходимо. </li><li> Отразить вертикально эмбрионов встроенные в желе с помощью лезвия бритвы и иглы. Для визуализации под микроскопом, осуществляться на основе либо один из двух шагов ниже, в зависимости от типа микроскоп стенда используется. </li><li> Инвертированный микроскоп: место готовых эмбриона блоков на долгое покровное, с эмбрионами в вертикальном положении. Убедитесь, что сторона эмбриона с наименьшим количеством желе будет находиться в более тесном контакте с целью. </li><li> Вертикальный микроскоп: сделайте две стопки с четырьмя # 1 покровные склеенных суперклеем для использования в качестве &quot;поддерживает&quot; и место эмбриона блока в глицерина между &quot;поддерживает&quot;. Мост стеки с помощью длинного покровного. </li><li> Для конфокальной анализ, проверить рабочее расстояние цели, которые будут использоваться, чтобы узнать, можно ли изображение весь путь до конца эмбриона или только частично. Например, Д. MELANOGASTER эмбрионы ~ 0,55 мм в длину и может быть полностью отображаемого использованием Zeiss 20x План-Апо или 40x LD Нео-Fluor цели. Следующие веб-сайт содержит информацию об имеющихся целей Zeiss и дает вам возможность поиска целей в соответствии с рабочим расстоянием: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Представитель Результаты Поскольку эмбрионы остаются нетронутыми, этот метод может использоваться, чтобы взять точные измерения размера эмбриона и расстояния между паттернами экспрессии генов. На рисунке 1, мы показываем бластодерма стадии эмбрионов окрашивали ядерным пятно DAPI (синий), анти-Спинной белка (красный), SOG мРНК (желтый) и СНС мРНК (зеленый). Морфологические процессорыСЭС, таких как инвагинации мезодермы (рис. 2а, б) и миграции мезодермального клетки (рис. 3 и 4) также могут быть визуализированы с помощью этого метода. Различные Z-позиции вдоль оси Д. В. может быть получен путем изменения фокальной плоскости, как показано на рисунках 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Вертикальный оптический кусочек нетронутой эмбриона в стадии бластодермы. Двойное окрашивание на мРНК и белка. Целевая мРНК на месте зонды (SOG и СНС) и белка окрашивали первичного антитела (анти-Спинной) указаны на рисунке. DAPI был использован для обозначения ядер. Обратите внимание, что выражение SOG и СНС расположены вершиной в цитоплазме, в то время как выражение Спинной ядерный. Сильные сигналы от SOG зарождающейся стенограмм, которые расположены в ядрах можно также рассматривать в этом увеличении. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Вертикальная съемка нетронутыми gastrulating эмбриона. Зондов мРНК использовали и их цвета указаны на рисунке. ) Отметим, что на этой стадии, три гена, окрашивали же фтор (СНС, SOG и DPP, в зеленый цвет), выражаются в пространственно разделенных областях. Инвагинирующий мезодермы выражает СНС, нейробластов слоя выражает инд и эктодермы выражает DPP, а SOG выражении все еще ​​присутствует в вентральной области нервной системы. Б) В глубоком конфокальной плоскости того же зародыша, отметим, база инвагинирующий мезодермы сильно выражает СНС, но его апикальной области выражает более низких уровнях. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Вертикальная съемка нетронутыми эмбрион зародыш группу расширенного SOG РНК (желтый);. Улитка, инд и DPP мРНК (зеленый), Спинной белка (красный). Ядра окрашивали DAPI (синий). А) в фокальной плоскости вблизи эмбриона голову. B) Другой фокальной плоскости в багажнике области же эмбриона. Обратите внимание, масса мезодермального клетки до латеральной миграции (сравните с рис 4) плотно прилегающая к вентральной срединной линии по обе стороны зародышевой группа расширенной эмбриона. Расслоения нейробластов помечены зеленым цветом (инд и СНС). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Вертикальная съемка нетронутыми эмбриона во время зародыш расширение группы SOG РНК (желтый);. Улитка, инд и DPP мРНК (зеленый), Спинной белка (красный). А) Примечание расслоения нейробластов из эпителия (стрелка), витражи, как для инд и СНС на данном этапе (зеленый). Отметим также ограничено выражением SOG на вентральной срединной линии (желтый). Выражение DPP на данном этапе можно увидеть на боковых сторон эмбриона (звездочка). B) Оптический раздел в том же эмбриона показано в конце эмбриона длиной, которая соответствует середине задней области. Вентральной срединной клетки окрашиваются для SOG.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Принимая крест изображения разделе эмбрионов дрозофилы может оказаться непростой задачей, так как он требует либо осторожны рассечение руки ломтиками 2 или использование встроенных средств массовой информации для микротома обработки, которая, как правило, вредно для люминесцентных окрашивания. Кроме того, Z-стеки, сделанные в конфокальной микроскопии могут быть использованы для 3D-реконструкция сечения изображений. Однако, это занимает много времени, чтобы сделать несколько тонких ломтиков конфокальной для точной 3D-реконструкции и фотообесцвечивания становится проблематичным. Еще одна проблема, когда изображения эмбрионов, которые установлены продольно является рассеяние света, которое происходит при достижении глубоких участках эмбриона, который также затрудняет принятие точные измерения флуоресцентных сигналов с целью количественной оценки белка или экспрессии мРНК уровни 1. Даже с двухфотонного конфокальной микроскопии, рассеяния света все еще является проблемой из-за непрозрачности материала желтка в середине эмбрион, который делает выбор монтажных средств массовой информации для оптимальной прозрачности образца, будет ограниченным. Чтобы обойти эти проблемы, новые технологии, называемой &quot;End-на&quot; изображение позиционирования эмбрионов вертикально недавно был разработан для изображения в реальном времени и фиксированных образцов 4. В данной работе мы разработали новый протокол для вертикально установленных эмбрионов, которое позволяет простым подготовки и визуализации фиксированных эмбрионов или тканей любого размера и формы, которые окрашивают несколько зондов на месте 3. Наш метод заключается в использовании установки средств массовой информации с желатиновой последовательности, которая используется для накрыть выровнены эмбриона внутри нее. Вырезать блоки этой монтажа сред, содержащих встроенный эмбрионы могут быть расположены вертикально перед изображениями в любом типе конфокальной микроскопии. По вложения эмбрионов в желе и располагая их по вертикали, мы можем принять горизонтальное сечения с помощью конфокальной микроскопии, при котором клетки вдоль спинной-вентральной оси эмбриона представлены одновременно. Это значительное улучшение по количественной цели, поскольку проблемы рассеяния света и фотообесцвечивания флуоресцентных красителей, который происходит в обычной Z-Stack реконструкция продольно установленный эмбрионов в настоящее время устранены. Таким образом, количественная оценка экспрессии гена или белка вдоль спинной-вентральной оси является точной, так как клетки, расположенные на противоположных спинно-вентральной позиции изображаются в то же время и в то же конфокальной Z-позиции. Кроме того, описанный метод позволяет получить полную 2-D изображения по спинно-вентральной оси от 3-D эмбриона без использования сложных вычислительных методов разворачивания для визуализации клеток на различных позициях вдоль оси Д. В. 6. Некоторые критические шаги включают удаления избытка глицерина после выравнивания эмбрионов, чтобы избежать раскола между двумя слоями желе. Однако, если образец слишком обезвоженной, результирующее изображение будет деформировано и неправильные морфологии. Кроме того, если средний желе вокруг эмбриона режется под углом, а не прямо, результирующее изображение может показаться менее круглыми и более овулярный в форме, из-за неверного позиционирования эмбрионов под углом, отличным от 90 градусов. Наконец, если желе не режется достаточно близкие к эмбрион на передних / задних концов, это не представляется возможным получить правильное изображение, поскольку рабочее расстояние цель была бы в основном используется для фокус в желе, а не эмбриона. Еще один важный шаг, который может быть необходимо при изображении конце gastrulating эмбрион тщательно сортировать этапах интерес к сфере до приведения их в соответствие. Как правило, эмбрионы поставленный по морфологическим признакам, которые могут быть наиболее легко распознать, когда в продольном положении. Среди альтернативных изменений, которые могут быть сделаны с помощью этого метода заключается во включении анти-Fade реагента (например, р-фенилендиамина или PPD), во второй слой желе для защиты от фотообесцвечивания флуоресцентных красителей.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Несколько известных морфогенетические градиенты и сотовых движения происходят вдоль спинной / вентральной оси<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриона. Тем не менее, современные методы использовать для просмотра таких процессов несколько ограничены. Следующий протокол описывает новую технику для установки фиксированных и маркированы<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионов для корональных просмотра с конфокальной микроскопии. Этот метод состоит из вложение эмбрионов между двумя слоями глицерин желе монтажа средств массовой информации и изображений желе полосы расположены вертикально. Первый шаг для сэндвич эмбрионов, чтобы сделать тонкие залегания глицерин желе на слайде. Затем эмбрионы были тщательно выровнены по этой поверхности и покрыты вторым слоем желе. После Второй слой затвердевшей, полоски желе вырезать и перевернуть вертикально для работы с изображениями. Альтернативы описаны для визуализации эмбрионов в зависимости от типа микроскопа стенд, который будет использоваться. Поскольку все клетки вдоль спинной-вентральной оси изображаются в пределах одного конфокальной Z-плоскости, наш метод позволяет точного измерения и сравнения флуоресцентные сигналы без фотообесцвечивания или рассеяния света, общие для 3D реконструкции продольно установленный эмбрионов.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Здесь мы представляем монтажа протокол для окрашенных<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионов в вертикальном положении, что позволяет изображения сечений с помощью конфокальной микроскопии.

Вертикальная съемка Drosophila Эмбрионы

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K Views.  Case Western Reserve University. Здесь мы представляем монтажа протокол для окрашенных Drosophila Эмбрионов в вертикальном положении, что позволяет изображения сечений с помощью конфокальной микроскопии.

Video: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Сбор и подготовка Drosophila Эмбрионы для Электрофизиологические Запись и другие процедуры

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...