Сборка нуклеосом in situ для одномолекулярной корреляционно-силовой и флуоресцентной микроскопии

Методы работы с одиночными молекулами являются мощными инструментами для изучения механики, координации и состава хроматиновых систем. И поэтому исследователи всегда ищут лучшие методы генерации нуклеосомных субстратов. Здесь мы описываем протокол формирования нуклеосом на ДНК в C2 в одномолекулярном корреляционно-силовом и флуоресцентном микроскопе.

Как правило, нуклеосомные субстраты образуются путем сборки нуклеосом на ДНК, содержащей сильные позиционирующие последовательности, с помощью солевого диализа. Хотя у этого есть преимущества, он генерирует искусственно стабильные нуклеосомы и тяжело справляется с реагентами. Наш протокол подготавливает нуклеосомные субстраты для одномолекулярной коррелированной силовой и флуоресцентной микроскопии без специфических последовательностей ДНК и с гораздо меньшим количеством реагентов в течение нескольких минут.

Этот протокол позволяет собирать нуклеосом на нативных последовательностях ДНК, легко регулировать плотность нуклеосом, а также сокращать время подготовки и использования реагентов. Кроме того, образование тросов нуклеосомной ДНК в C2 упрощает экспериментальный рабочий процесс и делает удобным встроенную визуализацию и манипуляции с одной молекулой. Когда равномерное и специфическое позиционирование нуклеосом не является существенной частью эксперимента, наши результаты могут помочь ученым более эффективно изучать хроматин и его добывающие белки на уровне одной молекулы.

Благодаря сэкономленному времени и ресурсам можно провести больше экспериментов для дальнейшего изучения дополнительных переменных и условий. Применимые области исследований, о которых мы сейчас думаем, включают механику хроматина, которая регулируется вариантами гистонов и другими посттрансляционными модификациями. Мы также думаем о биофизических взаимодействиях и кинетике других хроматин-связывающих белков.

И, наконец, мы также думаем о процессах сборки высшего порядка, управляемых нуклеосомами, таких как биомолекулярная конденсация.