Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Las técnicas de molécula única son herramientas poderosas para estudiar la mecánica, la coordinación y la composición de los sistemas de cromatina. Y por lo tanto, los investigadores siempre están buscando mejores métodos para generar sustratos de nucleosomas. Aquí describimos un protocolo para formar nucleosomas a través del ADN en C2 en un microscopio de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula.

Por lo general, los sustratos de nucleosomas se fabrican ensamblando nucleosomas en el ADN que contiene secuencias de posicionamiento fuertes a través de la diálisis salina. Aunque esto tiene ventajas, genera nucleosomas artificialmente estables y es pesado con los reactivos. Nuestro protocolo prepara sustratos de nucleosomas para la microscopía de fuerza correlacionada y fluorescencia de una sola molécula sin secuencias de ADN específicas y con muchos menos reactivos, todo en cuestión de minutos.

Este protocolo permite el ensamblaje de nucleosomas en secuencias de ADN nativo, un fácil ajuste de la densidad de nucleosomas, así como un menor tiempo de preparación y uso de reactivos. Además, la formación de ataduras de ADN nucleosomal en C2 permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y la comodidad de la visualización y manipulación integradas de una sola molécula. Cuando el posicionamiento uniforme y específico de los nucleosomas no es una parte esencial del experimento, nuestros hallazgos pueden ayudar a los científicos a estudiar la cromatina y sus proteínas mineras a nivel de molécula individual de manera más eficiente.

Con el tiempo y los recursos ahorrados, se pueden realizar más experimentos para investigar más a fondo las variables y condiciones adicionales. Las áreas de investigación aplicables en las que estamos pensando actualmente incluyen la mecánica de la cromatina que está regulada por variantes de histonas y otras modificaciones postraduccionales. También estamos pensando en los compromisos biofísicos y la cinética de otras proteínas de unión a la cromatina.

Y, por último, también estamos pensando en los procesos de ensamblaje de orden superior impulsados por nucleosomas, como la condensación biomolecular.