Tek molekül teknikleri, kromatin sistemlerinin mekaniğini, koordinasyonunu ve bileşimini incelemek için güçlü araçlardır. Bu nedenle, araştırmacılar her zaman nükleozom substratları oluşturmak için daha iyi yöntemler ararlar. Burada, tek bir molekül korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobunda C2'deki DNA boyunca nükleozomlar oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz.
Tipik olarak, nükleozom substratları, tuz diyalizi yoluyla güçlü konumlandırma dizileri içeren DNA üzerine nükleozomların birleştirilmesiyle yapılır. Bunun avantajları olmasına rağmen, yapay olarak kararlı nükleozomlar üretir ve reaktiflerle ağır bir şekilde kullanılır. Protokolümüz, belirli DNA dizileri olmadan ve çok daha az reaktifle tek molekül ilişkili kuvvet ve floresan mikroskobu için nükleozom substratlarını dakikalar içinde hazırlar.
Bu protokol, doğal DNA dizileri üzerinde nükleozom montajı, nükleozom yoğunluğunun kolay ayarlanmasının yanı sıra daha az hazırlık süresi ve reaktif kullanımını sağlar. Ek olarak, C2'de nükleozomal DNA bağlarının oluşumu, daha basit deneysel iş akışını ve yerleşik tek molekül görselleştirme ve manipülasyonunun rahatlığını sağlar. Düzgün ve spesifik nükleozom konumlandırma deneyin önemli bir parçası olmadığında, bulgularımız bilim adamlarının kromatin ve madencilik proteinlerini tek molekül düzeyinde daha verimli bir şekilde incelemelerine yardımcı olabilir.
Tasarruf edilen zaman ve kaynaklarla, ek değişkenleri ve koşulları daha fazla araştırmak için daha fazla deney yapılabilir. Şu anda düşündüğümüz uygulanabilir araştırma alanları arasında, histon varyantları ve diğer translasyon sonrası modifikasyonlar tarafından düzenlenen kromatin mekaniği bulunmaktadır. Ayrıca diğer kromatin bağlayıcı proteinlerin biyofiziksel etkileşimleri ve kinetiği hakkında da düşünüyoruz.
Ve son olarak, biyomoleküler yoğunlaşma gibi nükleozom güdümlü üst düzey montaj süreçleri hakkında da düşünüyoruz.
