Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

As técnicas de molécula única são ferramentas poderosas para estudar a mecânica, a coordenação e a composição dos sistemas de cromatina. E, portanto, os pesquisadores estão sempre procurando melhores métodos para gerar substratos de nucleossomos. Aqui descrevemos um protocolo para formar nucleossomos através do DNA em C2 em um microscópio de força correlativa e fluorescência de molécula única.

Normalmente, os substratos de nucleossomos são feitos pela montagem de nucleossomos no DNA contendo sequências de posicionamento fortes por meio de diálise salina. Embora isso tenha vantagens, gera nucleossomos artificialmente estáveis e é pesado com reagentes. Nosso protocolo prepara substratos de nucleossomos para microscopia de força e fluorescência correlacionada de molécula única sem sequências específicas de DNA e com muito menos reagentes, tudo em minutos.

Este protocolo permite a montagem de nucleossomos em sequências de DNA nativas, fácil ajuste da densidade de nucleossomos, bem como menor tempo de preparação e uso de reagentes. Além disso, a formação de amarras de DNA nucleossômico em C2 permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e a conveniência de visualização e manipulação de uma única molécula integrada. Quando o posicionamento uniforme e específico do nucleossomo não é uma parte essencial do experimento, nossas descobertas podem ajudar os cientistas a estudar a cromatina e suas proteínas de mineração no nível de uma única molécula com mais eficiência.

Com o tempo e os recursos economizados, mais experimentos podem ser feitos para investigar melhor variáveis e condições adicionais. As áreas de pesquisa aplicáveis nas quais estamos pensando atualmente incluem a mecânica da cromatina que é regulada por variantes de histonas e outras modificações pós-traducionais. Também estamos pensando nos engajamentos biofísicos e na cinética de outras proteínas de ligação à cromatina.

E, finalmente, também estamos pensando nos processos de montagem de ordem superior impulsionados por nucleossomos, como a condensação biomolecular.