Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов

В данной работе мы представляем и сравниваем методы формирования сфероидов, которые могут быть использованы для анализа клеточного метаболизма и распределения кислорода с помощью микроскопии живых клеток. В последние годы флуоресцентная микроскопия в течение жизни широко используется для исследования метаболических биомаркеров, таких как NADPH и FAD в живых клетках, и было разработано несколько флуоресцентных наночастиц для мультиплексирования таких измерений с визуализацией оксигенации клеток и тканей. Многоклеточные сфероиды, органоиды и орган-на-чипе могут воспроизводить сложную микросреду, подобную in-vivo, сводя к минимуму потребность в исследованиях на животных.

Для производства сфероидов мы показываем различные методы формования, которые могут варьироваться от низкой до высокой производительности. Они также подчеркивают свою оптическую доступность, совместимость с флуоресцентным микроскопом для визуализации в течение всего срока службы и возможность включения компонентов внеклеточного матрикса. Таким образом, несмотря на то, что 3D-модели in vitro обеспечивают лучший контекст по сравнению с 2D-культурами, их высокая вариабельность, низкая воспроизводимость и неполная отчетность об экспериментах остаются проблемой.

Такие параметры, как размер сфероида, состав питательных веществ, внеклеточная вязкость и даже методы формирования сфероидов, могут привести к увеличению клеточной гетерогенности. С помощью этого протокола мы стремимся гармонизировать и стандартизировать методы производства сфероидов, выделяя ключевые аспекты, важные для непрерывного и многопараметрического анализа сфероидов с использованием микроскопии FLIM.