L'obiettivo di questa ricerca è quello di affrontare gli effetti della siccità sull'agricoltura. Mentre il clima continua a cambiare, c'è un aumento della siccità e la siccità influisce sulla sicurezza alimentare. La metabolomica è importante per identificare e quantificare l'impatto che la siccità ha sul nostro cibo.
Una grande sfida nella metabolomica è raggiungere un alto livello di certezza dei composti identificati. Utilizzando la metossiammina al posto dell'idrossilammina nella fase di ossilaminazione, abbiamo migliorato l'efficienza della successiva fase di sililazione poiché il gruppo metossi non reagisce con l'MSTFA. I metodi attuali per osservare le risposte delle piante allo stress ambientale si concentrano su processi o tessuti specifici.
Mentre questo metodo è più integrativo rilevando segnali chimici nel prodotto finale del grano. In futuro, vorremmo utilizzare questo metodo per capire come la siccità e la consociazione influiscono sull'orzo. L'orzo è un cereale importante per la sicurezza alimentare e vogliamo capire come il cambiamento climatico lo influenzerà.
Per iniziare, caricare 200 milligrammi di farina d'orzo in un serbatoio di solvente per estrazione in fase solida, o SPE. Mettete a bagno la farina con 200 microlitri di metanolo per 20 minuti a macerare. Rimuovere il metanolo attraverso l'evaporazione sotto vuoto per 30 minuti.
Dopo l'asciugatura, collegare la colonna a un collettore del vuoto. Estrarre la frazione di componenti non polari A con diclorometano in una fiala da 10 millilitri e far funzionare il collettore del vuoto fino a quando la farina non è asciutta. Successivamente, aggiungere una miscela di metanolo e acqua deionizzata per estrarre la frazione B dei componenti polari in una fiala da 10 millilitri.
Azionare il collettore del vuoto fino a quando la farina non sarà asciutta. Aggiungere lo standard 1 e lo standard 2 alla frazione A e miscelare mediante pipettaggio ripetuto. Far evaporare completamente il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
Quindi risciogliere il campione in etere metil-terz-butilico, o MTBE, prima di aggiungere metanolo e metossido di sodio nella fiala. Lasciare procedere la transesterificazione per 90 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione magnetica. Aggiungere acido cloridrico acquoso alla soluzione.
Mescolare la soluzione acidificata con diclorometano. Raccogliere il contenuto della fiala con una pipetta lunga Pasteur e lasciare che le fasi si separino nella pipetta. Lavare la fase organica aggiungendo acido cloridrico acquoso.
Anche in questo caso, raccogliere il contenuto della fiala con una pipetta lunga Pasteur e lasciare che le fasi si separino nella pipetta. Trasferire la fase organica inferiore in una nuova fiala ed evaporare a secco utilizzando un evaporatore rotante. Quindi, aggiungere solfato di sodio anidro a una colonna SPE.
Sciogliere il campione evaporato in diclorometano e caricarlo sulla colonna SPE. Eluire la frazione 1 con tre porzioni di n-esano e MTBE in un flaconcino da 10 millilitri. Far evaporare la soluzione contenente la frazione 1 a secco su un evaporatore rotante.
Risciogliere il campione in n-esano e trasferirlo in una fiala dell'autocampionatore per GC/MS. Successivamente, eluire la prefrazione 2 dalla colonna SPE con tre porzioni successive di n-esano e MTBE in una fiala da 10 millilitri. Dopo aver evaporato la prefrazione 2 a secco, riscioglierla in piridina anidra e aggiungere MSTFA.
Usando le fascette, fissare un guanto nitro sopra l'estremità di una siringa con lo stantuffo rimosso. Riempi il palloncino con argon anidro e collega un ago monouso alla siringa. Spingere la siringa a palloncino attraverso il setto del flacone contenente il reagente anidro e inserire una seconda siringa con un ago lungo per aspirare il solvente.
Lavare la fiala del campione con un getto delicato di argon anidro. Dopo aver sigillato la fiala con parafilm, immergerla in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo la sililazione, raffreddare la frazione 2 a temperatura ambiente per cinque minuti e caricarla in una fiala dell'autocampionatore.
Aggiungere gli standard 3 e 4 alla frazione B e miscelare mediante pipettaggio ripetuto. Trasferire due e quattro millilitri di miscela di frazione B in una nuova fiala per trasformarla rispettivamente nella frazione 3 e nella frazione 4. Evaporare la prefrazione 3 a secco su un evaporatore rotante, seguita da coevaporazione con piridina anidra.
Risciogliere la prefrazione 3 nella piridina anidra e aggiungere il trimetilsiliimidazolo. Lavare la fiala del campione con un getto delicato di argon anidro. Dopo aver sigillato la fiala del campione con parafilm, riscaldare per 20 minuti in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius.
Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere n-esano e acqua deionizzata. Mescolare la miscela e trasferire la fase organica superiore in una fiala di autocampionatore utilizzando una lunga pipetta Pasteur. Evaporare la prefrazione 4 fino a secchezza su un evaporatore rotante, seguita da coevaporazione con piridina anidra.
Risciogliere il campione in piridina anidra e aggiungere metossilammina cloridrato. Dopo aver lavato la fiala con argon anidro, ossamare la fiala sigillata con parafilm per 30 minuti in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius. Una volta che la fiala si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere MSTFA e sililare per 20 minuti in un bagno d'olio.
Successivamente, aggiungere l'n-esano e l'acqua deionizzata nella fiala e raccogliere la fase acquosa inferiore utilizzando una pipetta lunga Pasteur. Dopo l'ultimo lavaggio, evaporare la fase acquosa fino a secchezza utilizzando un evaporatore rotante, quindi coevaporare il materiale rimanente con acetonitrile anidro. Risciogliere il campione in acetonitrile anidro e MSTFA.
Dopo aver lavato la fiala con argon anidro, riscaldare la fiala sigillata per 60 minuti in un bagno d'olio a 70 gradi Celsius. Caricare i campioni sul GC/MS utilizzando i volumi di iniezione specificati. Eseguire i campioni con un flusso diviso di 14 millilitri al minuto di elio a una temperatura di iniezione di 250 gradi Celsius.
Per le frazioni 1 e 2, aumentare la temperatura della colonna da 100 a 300 gradi Celsius a una velocità di 4 gradi Celsius al minuto. Dopo aver raggiunto i 300 gradi Celsius, mantenere la temperatura per 10 minuti. Per la frazione 3, riscaldare e tenere la colonna a 300 gradi Celsius per l'intera durata.
Per la frazione 4, aumentare la temperatura della colonna da 70 a 142 gradi Celsius a 2,5 gradi Celsius al minuto. Mantieni la temperatura a 142 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aumentare la temperatura da 142 a 235 gradi Celsius a 4 gradi Celsius al minuto, mantenendo la posizione per 10 minuti.
Infine, cuocete la colonna a 320 gradi per 8 minuti.
