L’objectif de cette recherche est d’examiner les effets de la sécheresse sur l’agriculture. Alors que le climat continue de changer, il y a une augmentation des sécheresses et la sécheresse affecte la sécurité alimentaire. La métabolomique est importante pour identifier et quantifier l’impact de la sécheresse sur notre alimentation.
Un grand défi en métabolomique est d’atteindre un haut niveau de certitude des composés identifiés. En utilisant de la méthoxyamine au lieu de l’hydroxylamine dans l’étape d’oxymation, nous avons amélioré l’efficacité de l’étape de silylation suivante car le groupe méthoxy ne réagit pas avec le MSTFA. Les méthodes actuelles d’observation des réponses des plantes au stress environnemental se concentrent sur des processus ou des tissus spécifiques.
Alors que cette méthode est plus intégrative en détectant des signaux chimiques dans le produit céréalier final. À l’avenir, nous aimerions utiliser cette méthode pour comprendre comment la sécheresse et les cultures intercalaires affectent l’orge. L’orge est une céréale importante pour la sécurité alimentaire, et nous voulons comprendre comment les changements climatiques l’affecteront.
Pour commencer, chargez 200 milligrammes de farine d’orge dans un réservoir de solvant d’extraction en phase solide, ou SPE. Faites macérer la farine avec 200 microlitres de méthanol pendant 20 minutes. Retirez le méthanol par évaporation sous vide pendant 30 minutes.
Une fois sec, fixez la colonne à un collecteur sous vide. Extraire les composants non polaires fraction A avec du dichlorométhane dans un flacon de 10 millilitres et faire fonctionner le collecteur sous vide jusqu’à ce que la farine soit sèche. Ensuite, ajoutez un mélange de méthanol et d’eau déminéralisée pour extraire les composants polaires fraction B dans un flacon de 10 millilitres.
Faites fonctionner le collecteur sous vide jusqu’à ce que la farine soit sèche. Ajouter l’étalon 1 et l’étalon 2 à la fraction A et mélanger par pipetage répété. Évaporez complètement le solvant sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif.
Ensuite, dissolvez à nouveau l’échantillon dans de l’éther méthyltert-butylique, ou MTBE, avant d’ajouter du méthanol et du méthoxyde de sodium dans le flacon. Laisser la transestérification se poursuivre pendant 90 minutes à température ambiante sous agitation magnétique. Ajouter de l’acide chlorhydrique aqueux à la solution.
Mélangez la solution acidifiée avec du dichlorométhane. Prélever le contenu du flacon à l’aide d’une longue pipette Pasteur, et laisser les phases se séparer dans la pipette. Laver la phase organique en ajoutant de l’acide chlorhydrique aqueux.
Encore une fois, prélevez le contenu du flacon à l’aide d’une longue pipette Pasteur et laissez les phases se séparer dans la pipette. Transférez la phase organique inférieure dans un nouveau flacon et évaporez-la à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif. Ensuite, ajoutez du sulfate de sodium anhydre à une colonne SPE.
Dissoudre l’échantillon évaporé dans du dichlorométhane et le charger sur la colonne SPE. Éluer la fraction 1 avec trois portions de n-hexane et de MTBE dans un flacon de 10 millilitres. Évaporer la solution contenant la fraction 1 à la siccité sur un évaporateur rotatif.
Dissoudre à nouveau l’échantillon dans du n-hexane et le transférer dans un flacon d’échantillonneur automatique pour GC/MS. Ensuite, éluez la préfraction 2 de la colonne SPE avec trois portions ultérieures de n-hexane et de MTBE dans un flacon de 10 millilitres. Après avoir évaporé la pré-fraction 2 à sec, la redissoudre dans de la pyridine anhydre et ajouter du MSTFA.
À l’aide d’attaches zippées, fixez un gant nitro sur l’extrémité d’une seringue avec le piston retiré. Remplissez le ballon d’argon anhydre et fixez une aiguille jetable à la seringue. Poussez la seringue à ballonnet dans le septum du flacon contenant le réactif anhydre et insérez une deuxième seringue avec une longue aiguille pour aspirer le solvant.
Rincez le flacon d’échantillon avec un léger jet d’argon anhydre. Après avoir scellé le flacon avec du parafilm, placez-le dans un bain d’huile à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après la silylation, refroidir la fraction 2 à température ambiante pendant cinq minutes et la charger dans un flacon d’échantillonneur automatique.
Ajouter les étalons 3 et 4 à la fraction B et mélanger par pipetage répété. Transférez deux et quatre millilitres de mélange de fraction B dans un nouveau flacon pour les transformer en fraction 3 et fraction 4 respectivement. Évaporer la pré-fraction 3 jusqu’à la siccité sur un évaporateur rotatif, suivie d’une coévaporation avec de la pyridine anhydre.
Redissoudre la préfraction 3 dans de la pyridine anhydre et ajouter le triméthylsilyimidazole. Rincez le flacon d’échantillon avec un léger jet d’argon anhydre. Après avoir scellé le flacon d’échantillon avec du parafilm, chauffez-le pendant 20 minutes dans un bain d’huile à 70 degrés Celsius.
Après avoir refroidi la solution à température ambiante, ajoutez du n-hexane et de l’eau déminéralisée. Mélangez le mélange et transférez la phase organique supérieure dans un flacon d’échantillonneur automatique à l’aide d’une longue pipette Pasteur. Évaporer la préfraction 4 jusqu’à ce qu’elle devienne sèche sur un évaporateur rotatif, suivie d’une coévaporation avec de la pyridine anhydre.
Dissoudre à nouveau l’échantillon dans de la pyridine anhydre et ajouter du chlorhydrate de méthoxylamine. Après avoir rincé le flacon avec de l’argon anhydre, oxamate le flacon scellé au parafilm pendant 30 minutes dans un bain d’huile à 70 degrés Celsius. Une fois le flacon refroidi à température ambiante, ajoutez du MSTFA et silylate pendant 20 minutes dans un bain d’huile.
Ensuite, ajoutez du n-hexane et de l’eau désionisée dans le flacon et prélevez la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une longue pipette Pasteur. Après le dernier lavage, évaporez la phase aqueuse jusqu’à ce qu’elle soit sèche à l’aide d’un évaporateur rotatif, puis coévaporez le reste du matériau avec de l’acétonitrile anhydre. Dissoudre à nouveau l’échantillon dans de l’acétonitrile anhydre et du MSTFA.
Après avoir rincé le flacon avec de l’argon anhydre, chauffez le flacon scellé pendant 60 minutes dans un bain d’huile à 70 degrés Celsius. Chargez les échantillons sur la GC/MS en utilisant les volumes d’injection spécifiés. Analysez les échantillons avec un flux fractionné de 14 millilitres par minute d’hélium à une température d’injection de 250 degrés Celsius.
Pour les fractions 1 et 2, augmentez la température de la colonne de 100 à 300 degrés Celsius à raison de 4 degrés Celsius par minute. Après avoir atteint 300 degrés Celsius, maintenez la température pendant 10 minutes. Pour la fraction 3, chauffez et maintenez la colonne à 300 degrés Celsius pendant toute la durée de la course.
Pour la fraction 4, augmentez la température de la colonne de 70 à 142 degrés Celsius à 2,5 degrés Celsius par minute. Maintenez la température à 142 degrés Celsius pendant 10 minutes. Augmentez ensuite la température de 142 à 235 degrés Celsius à 4 degrés Celsius par minute, en maintenant pendant 10 minutes.
Enfin, faites cuire la colonne à 320 degrés Celsius pendant 8 minutes.
