Ziel dieser Forschung ist es, die Auswirkungen von Dürren auf die Landwirtschaft zu untersuchen. Mit dem fortschreitenden Klimawandel nehmen Dürren zu, und Dürren beeinträchtigen die Ernährungssicherheit. Die Metabolomik ist wichtig, um die Auswirkungen von Dürren auf unsere Nahrung zu identifizieren und zu quantifizieren.
Eine große Herausforderung in der Metabolomik besteht darin, ein hohes Maß an Sicherheit der identifizierten Verbindungen zu erreichen. Durch die Verwendung von Methoxyamin anstelle von Hydroxylamin im Oximierungsschritt haben wir die Effizienz des nachfolgenden Silylierungsschritts verbessert, da die Methoxygruppe nicht mit MSTFA reagiert. Aktuelle Methoden, um die Reaktionen von Pflanzen auf Umweltstress zu beobachten, konzentrieren sich auf bestimmte Prozesse oder Gewebe.
Diese Methode ist integrativer, indem sie chemische Signale im Endprodukt des Getreides detektiert. In Zukunft möchten wir mit dieser Methode verstehen, wie sich Trockenheit und Mischkulturen auf Gerste auswirken. Gerste ist ein wichtiges Getreide für die Ernährungssicherheit, und wir wollen verstehen, wie sich ein sich veränderndes Klima darauf auswirken wird.
Laden Sie zunächst 200 Milligramm Gerstenmehl in ein Lösungsmittelreservoir für die Festphasenextraktion (SPE). Das Mehl mit 200 Mikrolitern Methanol 20 Minuten lang einweichen, um es zu mazerieren. Entfernen Sie das Methanol durch Verdampfen unter Vakuum für 30 Minuten.
Befestigen Sie die Säule nach dem Trocknen an einem Vakuumverteiler. Extrahieren Sie die unpolaren Bestandteile der Fraktion A mit Dichlormethan in ein 10-Milliliter-Fläschchen und lassen Sie den Vakuumverteiler laufen, bis das Mehl trocken ist. Fügen Sie anschließend eine Mischung aus Methanol und entionisiertem Wasser hinzu, um die polare Komponentenfraktion B in ein 10-Milliliter-Fläschchen zu extrahieren.
Lassen Sie den Vakuumverteiler laufen, bis das Mehl trocken ist. Geben Sie Standard 1 und Standard 2 zur Fraktion A und mischen Sie durch wiederholtes Pipettieren. Verdampfen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer vollständig.
Lösen Sie dann die Probe erneut in Methyl-tert-butylether (MTBE) auf, bevor Sie Methanol und Natriummethoxid in das Fläschchen geben. Die Umesterung wird 90 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Magnetrühren durchgeführt. Geben Sie wässrige Salzsäure in die Lösung.
Mischen Sie die angesäuerte Lösung mit Dichlormethan. Sammeln Sie den Inhalt des Fläschchens mit einer langen Pasteurpipette und lassen Sie die Phasen in der Pipette trennen. Waschen Sie die organische Phase durch Zugabe von wässriger Salzsäure.
Sammeln Sie erneut den Inhalt des Fläschchens mit einer langen Pasteurpipette und lassen Sie die Phasen in der Pipette trennen. Die untere organische Phase in ein neues Fläschchen überführen und mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampfen. Geben Sie als Nächstes wasserfreies Natriumsulfat in eine SPE-Säule.
Die verdampfte Probe wird in Dichlormethan aufgelöst und auf die SPE-Säule geladen. Fraktion 1 mit drei Anteilen n-Hexan und MTBE in ein 10-Milliliter-Fläschchen eluieren. Die Lösung, die die Fraktion 1 enthält, wird auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft.
Löse die Probe wieder in n-Hexan auf und übertrage sie in ein Autosampler-Fläschchen für GC/MS. Als nächstes eluiert die Vorfraktion 2 aus der SPE-Säule mit drei nachfolgenden Abschnitten von n-Hexan und MTBE in ein 10-Milliliter-Fläschchen. Nach dem Verdampfen der Vorfraktion 2 bis zur Trockenheit wird sie wieder in wasserfreiem Pyridin aufgelöst und MSTFA zugegeben.
Befestigen Sie mit Kabelbindern einen Nitro-Handschuh über dem Ende einer Spritze, wobei der Kolben entfernt ist. Füllen Sie den Ballon mit wasserfreiem Argon und befestigen Sie eine Einwegnadel an der Spritze. Schieben Sie die Ballonspritze durch das Septum der Flasche mit dem wasserfreien Reagenz und führen Sie eine zweite Spritze mit einer langen Nadel ein, um das Lösungsmittel aufzusaugen.
Spülen Sie das Probenfläschchen mit einem sanften Strahl wasserfreiem Argon. Nachdem Sie das Fläschchen mit Parafilm versiegelt haben, legen Sie es 15 Minuten lang in ein 70 Grad Celsius heißes Ölbad. Nach der Silylierung wird die Fraktion 2 fünf Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen und in ein Autosampler-Fläschchen gefüllt.
Die Standards 3 und 4 werden der Fraktion B zugesetzt und durch wiederholtes Pipettieren gemischt. Übertragen Sie zwei und vier Milliliter des Gemischs der Fraktion B in ein neues Fläschchen, um es zu Fraktion 3 bzw. Fraktion 4 zu verarbeiten. Die Vorfraktion 3 wird auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft, gefolgt von einer Co-Verdampfung mit wasserfreiem Pyridin.
Die Vorfraktion 3 in wasserfreiem Pyridin wieder auflösen und Trimethylsilyimidazol zugeben. Spülen Sie das Probenfläschchen mit einem sanften Strahl wasserfreiem Argon. Nachdem Sie das Probengefäß mit Parafilm verschlossen haben, erhitzen Sie es 20 Minuten lang in einem 70 Grad Celsius warmen Ölbad.
Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie n-Hexan und entionisiertes Wasser hinzu. Rühren Sie die Mischung um und geben Sie die obere organische Phase mit einer langen Pasteur-Pipette in ein Autosampler-Fläschchen. Die Vorfraktion 4 wird auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft, gefolgt von einer Co-Verdampfung mit wasserfreiem Pyridin.
Löse die Probe wieder in wasserfreiem Pyridin auf und füge Methoxylaminhydrochlorid hinzu. Nachdem Sie das Fläschchen mit wasserfreiem Argon gespült haben, oxamieren Sie das mit Parafilm versiegelte Fläschchen 30 Minuten lang in einem 70 Grad Celsius warmen Ölbad. Sobald die Durchstechflasche auf Raumtemperatur abgekühlt ist, MSTFA hinzufügen und 20 Minuten lang in einem Ölbad silylieren.
Geben Sie anschließend n-Hexan und deionisiertes Wasser in das Fläschchen und sammeln Sie die untere wässrige Phase mit einer langen Pasteurpipette. Nach der letzten Wäsche wird die wässrige Phase mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit eingedampft und das restliche Material mit wasserfreiem Acetonitril mitverdampft. Die Probe wird wieder in wasserfreiem Acetonitril und MSTFA.
Nachdem Sie das Fläschchen mit wasserfreiem Argon gespült haben, erhitzen Sie das verschlossene Fläschchen 60 Minuten lang in einem 70 Grad Celsius heißen Ölbad. Laden Sie die Proben mit den angegebenen Injektionsvolumina auf den GC/MS. Führen Sie die Proben mit einem geteilten Fluss von 14 Millilitern Helium pro Minute bei einer Injektionstemperatur von 250 Grad Celsius durch.
Erhöhen Sie für die Fraktionen 1 und 2 die Säulentemperatur von 100 auf 300 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von 4 Grad Celsius pro Minute. Halten Sie die Temperatur nach Erreichen von 300 Grad Celsius 10 Minuten lang. Für Fraktion 3 erhitzen Sie die Säule und halten sie während des gesamten Laufs bei 300 Grad Celsius.
Für Fraktion 4 erhöhen Sie die Säulentemperatur von 70 auf 142 Grad Celsius auf 2,5 Grad Celsius pro Minute. Halten Sie die Temperatur 10 Minuten lang bei 142 Grad Celsius. Erhöhen Sie dann die Temperatur von 142 auf 235 Grad Celsius bei 4 Grad Celsius pro Minute und halten Sie sie 10 Minuten lang.
Zum Schluss die Säule bei 320 Grad Celsius 8 Minuten backen.
