El objetivo de esta investigación es abordar los efectos de la sequía en la agricultura. A medida que el clima continúa cambiando, hay un aumento de la sequía, y la sequía afecta la seguridad alimentaria. La metabolómica es importante para identificar y cuantificar el impacto que la sequía tiene en nuestros alimentos.
Un gran desafío en metabolómica es lograr un alto nivel de certeza de los compuestos identificados. Al usar metoxiamina en lugar de hidroxilamina en el paso de oximación, hemos mejorado la eficiencia del paso de sililación posterior, ya que el grupo metoxi no reaccionará con MSTFA. Los métodos actuales para observar las respuestas de las plantas al estrés ambiental se centran en procesos o tejidos específicos.
Mientras que este método es más integrador al detectar señales químicas en el producto final del grano. En el futuro, nos gustaría utilizar este método para comprender cómo la sequía y los cultivos intercalados afectan a la cebada. La cebada es un grano importante para la seguridad alimentaria, y queremos entender cómo le afectará el cambio climático.
Para comenzar, cargue 200 miligramos de harina de cebada en un depósito de solvente de extracción en fase sólida, o SPE. Remojar la harina con 200 microlitros de metanol durante 20 minutos para macerar. Retire el metanol a través de la evaporación al vacío durante 30 minutos.
Después del secado, conecte la columna a un colector de vacío. Extraiga los componentes no polares fracción A con diclorometano en un vial de 10 mililitros y haga funcionar el colector de vacío hasta que la harina esté seca. A continuación, agregue una mezcla de metanol y agua desionizada para extraer los componentes polares de la fracción B en un vial de 10 mililitros.
Encienda el colector de vacío hasta que la harina esté seca. Añada la norma 1 y la norma 2 a la fracción A y mezcle mediante pipeteo repetido. Evapore completamente el solvente a presión reducida usando un evaporador rotativo.
A continuación, vuelva a disolver la muestra en éter metil terc-butílico, o MTBE, antes de añadir metanol y metóxido de sodio en el vial. Deje que la transesterificación proceda durante 90 minutos a temperatura ambiente bajo agitación magnética. Agregue ácido clorhídrico acuoso a la solución.
Mezclar la solución acidificada con diclorometano. Recoja el contenido del vial con una pipeta Pasteur larga y deje que las fases se separen en la pipeta. Lavar la fase orgánica añadiendo ácido clorhídrico acuoso.
De nuevo, recoja el contenido del vial con una pipeta Pasteur larga y deje que las fases se separen en la pipeta. Transfiera la fase orgánica inferior a un nuevo vial y evapore hasta la sequedad utilizando un evaporador rotativo. A continuación, agregue sulfato de sodio anhidro a una columna SPE.
Disuelva la muestra evaporada en diclorometano y cárguela en la columna SPE. Eluir la fracción 1 con tres porciones de n-hexano y MTBE en un vial de 10 mililitros. Evapore la solución que contiene la fracción 1 hasta la sequedad en un evaporador rotativo.
Vuelva a disolver la muestra en n-hexano y transfiérala a un vial de muestreador automático para GC/MS. A continuación, eluir la prefracción 2 de la columna SPE con tres porciones subsiguientes de n-hexano y MTBE en un vial de 10 mililitros. Después de evaporar la prefracción 2 hasta la sequedad, volver a disolverla en piridina anhidra y agregar MSTFA.
Con bridas, asegure un guante nitro sobre el extremo de una jeringa sin el émbolo. Llene el globo con argón anhidro y coloque una aguja desechable en la jeringa. Empuje la jeringa de balón a través del tabique del frasco que contiene el reactivo anhidro e inserte una segunda jeringa con una aguja larga para extraer el disolvente.
Enjuague el vial de muestra con un chorro suave de argón anhidro. Después de sellar el vial con parafilm, colóquelo en un baño de aceite a 70 grados centígrados durante 15 minutos. Después de la sililación, enfríe la fracción 2 a temperatura ambiente durante cinco minutos y cárguela en un vial de muestreador automático.
Añadir los patrones 3 y 4 a la fracción B y mezclar mediante pipeteo repetido. Transfiera dos y cuatro mililitros de la mezcla de la fracción B a un nuevo vial para procesarla en la fracción 3 y la fracción 4 respectivamente. Evaporar la prefracción 3 hasta la sequedad en un evaporador rotativo, seguido de coevaporación con piridina anhidra.
Volver a disolver la prefracción 3 en piridina anhidra y añadir trimetilsililimidazol. Enjuague el vial de muestra con un chorro suave de argón anhidro. Después de sellar el vial de muestra con parafilm, caliente durante 20 minutos en un baño de aceite a 70 grados centígrados.
Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue n-hexano y agua desionizada. Agite la mezcla y transfiera la fase orgánica superior a un vial de muestreador automático con una pipeta Pasteur larga. Evaporar la prefracción 4 hasta la sequedad en un evaporador rotativo, seguido de coevaporación con piridina anhidra.
Vuelva a disolver la muestra en piridina anhidra y agregue clorhidrato de metoxilamina. Después de enjuagar el vial con argón anhidro, oxamato el vial sellado con parafilm durante 30 minutos en un baño de aceite a 70 grados Celsius. Una vez que el vial se haya enfriado a temperatura ambiente, agregue MSTFA y sililato durante 20 minutos en un baño de aceite.
A continuación, añada n-hexano y agua desionizada en el vial y recoja la fase acuosa inferior con una pipeta Pasteur larga. Después del último lavado, evapore la fase acuosa hasta la sequedad utilizando un evaporador rotativo seguido de la coevaporación del material restante con acetonitrilo anhidro. Vuelva a disolver la muestra en acetonitrilo anhidro y MSTFA.
Después de enjuagar el vial con argón anhidro, caliente el vial sellado durante 60 minutos en un baño de aceite a 70 grados centígrados. Cargue muestras en el GC/MS utilizando los volúmenes de inyección especificados. Haga funcionar las muestras con un flujo dividido de 14 mililitros por minuto de helio a una temperatura de inyección de 250 grados Celsius.
Para las fracciones 1 y 2, aumente la temperatura de la columna de 100 a 300 grados Celsius a una velocidad de 4 grados Celsius por minuto. Después de alcanzar los 300 grados centígrados, mantenga la temperatura durante 10 minutos. Para la fracción 3, caliente y mantenga la columna a 300 grados centígrados durante la totalidad de la tirada.
Para la fracción 4, aumente la temperatura de la columna de 70 a 142 grados Celsius a 2,5 grados Celsius por minuto. Mantenga la temperatura a 142 grados centígrados durante 10 minutos. Luego aumente la temperatura de 142 a 235 grados centígrados a 4 grados centígrados por minuto, manteniendo durante 10 minutos.
Finalmente, hornea la columna a 320 grados centígrados durante 8 minutos.
