Мы изучили наши каналы, связанные с ощущением температуры, ощущением возраста и ощущением боли. Мы заинтересованы в экранировании низкомолекулярной активности в наших каналах и изучении механизмов их проведения. Мы провели скрининг двух активирующих TRPV1 агонистов и провели детальное исследование механизмов их действия.
Эта технология позволяет проводить количественный и одновременный мониторинг изменений кальция в нескольких клетках в режиме реального времени, что делает ее простым и быстрым подходом к исследовательским приложениям. Мы стремимся изучить механизм лечения различных заболеваний традиционной китайской медициной путем модернизации ионных каналов, связанных с кальцием. Для начала подготовьте стерильные стеклянные стекла диаметром восемь миллиметров и поместите их в 24-луночную пластину.
Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров буфера Poly-D-lycine. Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы обеспечить покрытие. Затем с помощью пипетки сбросить раствор покрытия из каждой лунки.
Вымойте слайды один раз с помощью PBS от Dulbecco и отложите вымытые слайды для последующего использования. Высейте клетки на подготовленную 24 луночную пластину с плотностью примерно 1,5 х 10 в степени 5 клеток на лунку, и поместите пластину в инкубатор до тех пор, пока клетки не прилипнут. Далее смешайте стоковый раствор Фура-2/АМ и Плурон Ф-127 с буфером Хэнка, содержащим 1,3 миллимолярных ионов кальция.
С помощью алюминиевой фольги накройте рабочий раствор Фура-2/АМ для защиты от света. Для предварительной обработки клеток перенесите предметные стекла с ячейками на новую 24-луночную пластину, содержащую буфер Хэнка. С помощью пипетки выбросьте буфер из каждой лунки и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров рабочего буфера Фура-2/АМ.
Инкубируйте планшет при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут, чтобы обеспечить загрузку зонда. Затем извлеките рабочий буфер Фура-2/АМ из каждой лунки и трижды промойте ячейки буфером Хэнка, чтобы удалить излишки Фура-2/АМ. Для начала получите предварительно обработанные клетки для визуализации одиночных клеток кальция и запустите все компоненты флуоресцентного микроскопа.
Откройте программное обеспечение для флуоресцентной визуализации из доступных вариантов. Выберите нужный протокол и нажмите «ОК». Затем выберите «Новый эксперимент» в главном меню, чтобы начать новую экспериментальную настройку.
Теперь установите перфузионную камеру на предметный столик микроскопа и осторожно поместите обработанные Fura-2/AM предметные стекла в камеру, содержащую буферный раствор Хэнка. Отрегулируйте фокусировку под белым светом для оптимального просмотра. Выберите Фокус на панели управления экспериментом.
Выберите желаемую длину волны для фокусировки, например 380 нанометров, и нажмите «Начать фокусировку», чтобы начать настройку фокуса. Отрегулируйте фокус на ячейках с помощью функции «Грубый фокус», чтобы приблизить объектив, а затем нажмите «Найти фокус» для точной настройки. Наблюдайте за экспрессией целевого белка по длинам волн FITC или TRITC.
Затем нажмите «Остановить фокусировку» и закройте панель фокусировки. Нажмите «Настроить эксперимент» на панели задач и выберите нужные этажи для визуализации в настройках конфигурации. Теперь нажмите кнопку «Область» в строке меню, чтобы определить области для визуализации, и выберите тип «Желаемое освещение» для визуализации.
Нажмите «Получить изображения», затем нажмите «ОК», чтобы захватить изображения. Определите нужные клетки, экспрессирующие целевой белок под действием флуоресценции, учитывая пустое считывание с контролем менее 380 нм. Чтобы отменить выбранную область, щелкните правой кнопкой мыши по кругу и выберите «Удалить область».
Откройте меню «Ссылки», установите флажок «Вычесть ссылки» и нажмите «ОК», чтобы применить фоновое вычитание. На панели управления экспериментом нажмите кнопку Данные журнала, чтобы записать данные эксперимента. В разделе «Таймлапс» панели управления установите интервал сбора данных на одну секунду.
Затем нажмите Zero Clock и Acquisition на панели управления экспериментом, чтобы начать сбор данных. Теперь примените обработку клеток в соответствии с требованиями. После завершения сбора данных нажмите «Пауза», чтобы остановить процесс.
Сохраните полученные данные и приступайте к анализу. Чтобы завершить эксперимент, нажмите «Файл» и выберите «Закрыть эксперимент». Наконец, закройте программное обеспечение и перенесите все сохраненные данные с компьютера.
Первичные кератиноциты, загруженные зондом Fura-2, отображали видимую морфологию клеток на длине волны 380 нанометров. Тепловой отклик кератиноцитов показал увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция при нагревании, аналогичная реакция наблюдалась при охлаждении. Тепловой ответ был отменен в кератиноцитах, в которых отсутствовал ген STIM1, что указывает на роль гена в термической передаче кальциевой сигнализации.
HEK293T клетки с избыточной экспрессией STIM1/Orai1 показали заметную тепловую реакцию при охлаждении, подтвердив успешную экспрессию генов, о чем свидетельствуют зеленые и красные флуоресцентные маркеры. Реакция на вход кальция в клетках на экспрессию STIM1-Orai1 была эффективно индуцирована последовательными изменениями внеклеточной концентрации кальция и издания циклопиазоновой кислоты через обильность. Прямое пипетирование капсаицина, агониста TRPV1, вызывало внеклеточный приток кальция в клетки, экспрессирующие плазмиду TRPV1.
