私たちは、温度感覚、年齢感覚、および痛み感覚に関連するチャネルを研究しました。私たちは、チャネル内の低分子の活性をスクリーニングし、そのメカニズムを研究することに興味を持っています。私たちは、2つのTRPV1活性化アゴニストをスクリーニングし、その作用機序について詳細な研究を行いました。
この技術により、複数の細胞におけるカルシウム変化をリアルタイム、定量的、かつ同時にモニタリングすることが可能となり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチとなります。私たちは、カルシウム関連イオンチャネルの近代化を通じて、さまざまな病気に対する漢方薬の治療メカニズムを探求することを目指しています。まず、直径8mmの滅菌スライドガラスを準備し、24ウェルプレートに入れます。
各ウェルに500マイクロリットルのPoly-D-lycineバッファーを加えます。スライドを摂氏37度で1時間インキュベートして、コーティングを可能にします。その後、ピペットを使用して、各ウェルからコーティング溶液を廃棄します。
スライドをダルベッコのPBSで一度洗い、洗ったスライドを後で使用するために取っておきます。調製した24ウェルプレートに、ウェルあたり5細胞の累乗で10の約1.5倍の密度で細胞を播種し、細胞が接着するまでプレートをインキュベーターに置きます。次に、Fura-2/AM原液とPluronic F-127を、1.3ミリモルのカルシウムイオンを含むハンク緩衝液と混合します。
アルミホイルを使用して、Fura-2 / AM作業溶液を覆い、光から保護します。細胞を前処理するために、スライドガラスを細胞とともにハンク緩衝液を含む新しい24ウェルプレートに移します。ピペットを使用して、各ウェルからバッファーを廃棄し、各ウェルに500マイクロリットルのFura-2/AMワーキングバッファーを追加します。
プレートを室温で暗所で30分間インキュベートし、プローブをローディングします。次に、各ウェルからFura-2/AMワーキングバッファーを取り出し、ハンクバッファーで細胞を3回洗浄して、余分なFura-2/AMを除去します。まず、シングルセルカルシウムイメージング用に前処理した細胞を入手し、蛍光顕微鏡のすべてのコンポーネントを開始します。
利用可能なオプションから蛍光イメージングソフトウェアを開きます。必要なプロトコルを選択し、[OK]をクリックします。次に、メイン メニューから [新しい実験] を選択して、新しい実験のセットアップを開始します。
次に、灌流チャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、Fura-2/AM処理した細胞スライドをハンクの緩衝液が入ったチャンバーに慎重に配置します。白色光の下でフォーカスを調整して、最適な表示を実現します。実験のコントロール パネルで [フォーカス] を選択します。
380ナノメートルなど、ピント合わせに必要な波長を選択し、[フォーカスの開始]をクリックしてフォーカル調整を開始します。ラフフォーカスを使用してセルのフォーカスを調整して対物レンズを近づけ、次にフォーカスを見つけて正確に調整します。FITCまたはTRITCの波長で標的タンパク質の発現を観察します。
次に、[フォーカスの停止]をクリックして、フォーカスパネルを閉じます。タスクバーの「実験の設定」をクリックし、設定でイメージング用のフロアを選択します。次に、メニューバーの[Region]ボタンをクリックして、イメージングの領域を定義し、イメージングに必要な照明タイプを選択します。
[画像の取得]をクリックし、[OK]を押して画像をキャプチャします。蛍光下で標的タンパク質を発現する目的の細胞を同定し、380ナノメートル未満のコントロールでのブランク読み取りを考慮します。選択した領域を元に戻すには、円を右クリックして[領域の削除]を選択します。
[参照]メニューを開き、[参照の減算]チェックボックスをオンにして、[OK]をクリックして背景の減算を適用します。[実験] コントロール パネルで [ログ データ] をクリックして、実験データを記録します。コントロールパネルの[タイムラプス]セクションで、[データ収集間隔]を1秒に設定します。
次に、ExperimentコントロールパネルのZero ClockとAcquireをクリックして、データ集録を開始します。次に、要件に従って細胞に処理を適用します。データ取得が完了したら、[一時停止]をクリックしてプロセスを停止します。
取得したデータを保存し、解析を進めます。実験を終了するには、[ファイル] をクリックし、[実験を閉じる] を選択します。最後に、ソフトウェアを閉じて、保存したすべてのデータをコンピューターから転送します。
Fura-2プローブをロードした初代ケラチノサイトは、波長380ナノメートルで可視細胞形態を示しました。ケラチノサイトの熱応答は、加熱中に細胞内カルシウムイオン濃度の増加を示し、冷却中にも同様の応答が観察されました。ケラチノサイトでは熱応答が消失し、STIM1遺伝子が欠損していたため、この遺伝子が熱カルシウムシグナル伝達に果たしていることが示されています。
STIM1/Orai1を過剰発現させた細胞HEK293T、冷却時に顕著な熱応答を示し、緑と赤の蛍光マーカーによって証明されるように、遺伝子発現の成功が確認されました。STIM1-Orai1を過剰に発現する細胞内の貯蔵操作カルシウム侵入応答は、細胞外カルシウム濃度の連続的な変化とシクロピアゾン酸の過剰化による増殖によって効果的に誘導されました。TRPV1アゴニストであるカプサイシンを直接ピペッティングすると、TRPV1プラスミドを発現する細胞に細胞外カルシウムの流入が引き起こされました。
