Abbiamo studiato i nostri canali relativi alla sensazione di temperatura, alla sensazione di età e alla sensazione di dolore. Siamo interessati allo screening delle attività di piccole molecole nei nostri canali e allo studio dei loro meccanismi. Abbiamo esaminato due agonisti attivanti TRPV1 e condotto uno studio dettagliato sui loro meccanismi d'azione.
Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale, quantitativo e simultaneo delle variazioni di calcio in più cellule, il che la rende un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca. Il nostro obiettivo è quello di esplorare il meccanismo di trattamento delle medicine tradizionali cinesi per le varie malattie attraverso la modernizzazione dei canali ionici correlati al calcio. Per iniziare, preparare vetrini sterili con diametro di otto millimetri e metterli in una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere 500 microlitri di tampone Poli-D-licina a ciascun pozzetto. Incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire il rivestimento. Quindi, utilizzando una pipetta, scartare la soluzione di rivestimento da ciascun pozzetto.
Lavare le diapositive una volta con il PBS di Dulbecco e mettere da parte le diapositive lavate per un uso successivo. Seminare le cellule sulla piastra a 24 pozzetti preparata a una densità di circa 1,5 volte 10 alla potenza di 5 cellule per pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore fino a quando le cellule non diventano aderenti. Quindi, mescolare la soluzione madre di Fura-2/AM e Pluronic F-127 con il tampone di Hank contenente 1,3 millimolari di ioni calcio.
Utilizzando un foglio di alluminio, coprire la soluzione di lavoro Fura-2/AM per proteggerla dalla luce. Per il pretrattamento delle cellule, trasferire i vetrini con le celle in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente il tampone di Hank. Utilizzando una pipetta, scartare il tampone da ciascun pozzetto e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavoro Fura-2/AM a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 30 minuti per consentire il caricamento della sonda. Quindi rimuovere il tampone di lavoro Fura-2/AM da ciascun pozzetto e lavare le celle tre volte con il tampone di Hank per rimuovere l'eccesso di Fura-2/AM. Per iniziare, ottenere le cellule pretrattate per l'imaging del calcio a singola cellula e avviare tutti i componenti del microscopio a fluorescenza.
Apri il software di imaging a fluorescenza dalle opzioni disponibili. Seleziona il protocollo richiesto e fai clic su OK. Quindi, scegli Nuovo esperimento dal menu principale per avviare una nuova configurazione sperimentale.
Ora, montare la camera di perfusione sul tavolino del microscopio e posizionare con cura i vetrini cellulari trattati con Fura-2/AM nella camera contenente la soluzione tampone di Hank. Regola la messa a fuoco sotto la luce bianca per una visione ottimale. Selezionare Messa a fuoco nel pannello di controllo dell'esperimento.
Scegli la lunghezza d'onda desiderata per la messa a fuoco, ad esempio 380 nanometri, e fai clic su Inizia messa a fuoco per avviare le regolazioni focali. Regola la messa a fuoco sulle celle usando Messa a fuoco approssimativa per avvicinare l'obiettivo, seguito da Trova messa a fuoco per regolazioni precise. Osservare l'espressione della proteina bersaglio mediante lunghezze d'onda di FITC o TRITC.
Quindi fare clic su Interrompi messa a fuoco e chiudere il pannello di messa a fuoco. Fare clic su Configura esperimento nella barra delle applicazioni e selezionare i piani desiderati per l'imaging nelle impostazioni di configurazione. Ora fai clic sul pulsante Regione nella barra dei menu per definire le aree per l'imaging e scegli il tipo di illuminazione desiderato per l'imaging.
Fare clic su Acquisisci immagini, quindi premere OK per acquisire le immagini. Identificare le cellule desiderate che esprimono la proteina bersaglio sotto fluorescenza, considerando la lettura in bianco con i controlli inferiori a 380 nanometri. Per annullare una regione selezionata, fare clic con il pulsante destro del mouse sul cerchio e selezionare Elimina regione.
Apri il menu Riferimenti, seleziona la casella Sottrai riferimenti e quindi fai clic su OK per applicare la sottrazione dello sfondo. Nel pannello di controllo Esperimento, fare clic su Log Data (Registra dati) per registrare i dati dell'esperimento. Nella sezione Time Lapse del pannello di controllo, impostare l'intervallo di acquisizione dati su un secondo.
Quindi fare clic su Zero Clock and Acquire sul pannello di controllo Esperimento per avviare l'acquisizione dei dati. Ora applica i trattamenti alle cellule secondo i requisiti. Una volta completata l'acquisizione dei dati, fare clic su Pausa per interrompere il processo.
Salvare i dati acquisiti e procedere con l'analisi. Per terminare l'esperimento, fai clic su File e seleziona Chiudi esperimento. Infine, chiudi il software e trasferisci tutti i dati salvati dal computer.
I cheratinociti primari caricati con la sonda Fura-2 hanno mostrato una morfologia cellulare visibile a una lunghezza d'onda di 380 nanometri. La risposta termica dei cheratinociti ha mostrato un aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio durante il riscaldamento con una risposta simile osservata durante il raffreddamento. La risposta termica è stata abolita nei cheratinociti, privi del gene STIM1 che indica il ruolo del gene nella segnalazione termica del calcio.
HEK293T cellule che esprimono STIM1/Orai1 hanno mostrato una notevole risposta termica dopo il raffreddamento, confermando il successo dell'espressione genica, come evidenziato dai marcatori di fluorescenza verdi e rossi. La risposta di ingresso del calcio operata dal deposito nelle cellule che esprimono STIM1-Orai1 è stata efficacemente indotta da cambiamenti sequenziali nella concentrazione extracellulare di calcio e nell'edizione dell'acido ciclopiazonico tramite profusione. Il pipettaggio diretto della capsaicina, un agonista di TRPV1, ha innescato l'afflusso extracellulare di calcio nelle cellule che esprimono il plasmide TRPV1.
