Estudamos nossos canais relacionados à sensação de temperatura, sensação de idade e sensação de dor. Estamos interessados em rastrear atividades de pequenas moléculas em nossos canais e no estudo de seus mecanismos. Rastreamos dois agonistas ativadores do TRPV1 e realizamos um estudo detalhado sobre seus mecanismos de ação.
Essa tecnologia permite o monitoramento em tempo real, quantitativo e simultâneo das alterações de cálcio em várias células, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa. Nosso objetivo é explorar o mecanismo de tratamento da medicina tradicional chinesa para as várias doenças por meio da modernização dos canais iônicos relacionados ao cálcio. Para começar, prepare lâminas de vidro estéreis com oito milímetros de diâmetro e coloque-as em uma placa de 24 poços.
Adicione 500 microlitros de tampão poli-D-licina a cada poço. Incube as lâminas a 37 graus Celsius por uma hora para permitir o revestimento. Em seguida, usando uma pipeta, descarte a solução de revestimento de cada poço.
Lave as lâminas uma vez com o PBS da Dulbecco e reserve as lâminas lavadas para uso posterior. Semeie as células na placa de 24 poços preparada a uma densidade de aproximadamente 1,5 vezes 10 elevado a 5 células por poço e coloque a placa na incubadora até que as células se tornem aderentes. Em seguida, misture a solução estoque Fura-2 / AM e o Pluronic F-127 com o tampão de Hank contendo 1,3 milimolar de íons de cálcio.
Usando papel alumínio, cubra a solução de trabalho Fura-2/AM para protegê-la da luz. Para pré-tratar as células, transfira as lâminas de vidro com as células para uma nova placa de 24 poços contendo o tampão de Hank. Usando uma pipeta, descarte o tampão de cada poço e adicione 500 microlitros de tampão de trabalho Fura-2 / AM a cada poço.
Incube a placa em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos para permitir o carregamento da sonda. Em seguida, remova o tampão de trabalho Fura-2 / AM de cada poço e lave as células três vezes com o tampão de Hank para remover o excesso de Fura-2 / AM. Para começar, obtenha as células pré-tratadas para imagens de cálcio de célula única e inicie todos os componentes do microscópio de fluorescência.
Abra o software de imagem de fluorescência a partir das opções disponíveis. Selecione o protocolo necessário e clique em OK. Em seguida, escolha Novo experimento no menu principal para iniciar uma nova configuração experimental.
Agora, monte a câmara de perfusão no microscópio stage e coloque cuidadosamente as lâminas de células tratadas com Fura-2 / AM na câmara contendo a solução tampão de Hank. Ajuste o foco sob luz branca para uma visualização ideal. Selecione Focar no painel de controle do experimento.
Escolha o comprimento de onda desejado para focar, como 380 nanômetros, e clique em Iniciar foco para iniciar os ajustes focais. Ajuste o foco nas células usando o Foco aproximado para aproximar a objetiva, seguido por Localizar foco para ajustes precisos. Observe a expressão da proteína alvo por comprimentos de onda de FITC ou TRITC.
Em seguida, clique em Parar foco e feche o painel de foco. Clique em Configurar experimento na barra de tarefas e selecione os andares desejados para geração de imagens nas definições de configuração. Agora clique no botão Região na barra de menus para definir as áreas para a imagem e escolha o tipo de iluminação desejada para a imagem.
Clique em Adquirir imagens e pressione OK para capturar imagens. Identificar as células desejadas que expressam a proteína alvo sob fluorescência, considerando a leitura em branco com os controles abaixo de 380 nanômetros. Para desfazer uma região selecionada, clique com o botão direito do mouse no círculo e selecione Excluir região.
Abra o menu Referências, marque a caixa Subtrair referências e clique em OK para aplicar a subtração em segundo plano. No painel de controle do experimento, clique em Dados de registro para registrar os dados do experimento. Na seção Time Lapse do painel de controle, defina o Data Acquisition Interval para um segundo.
Em seguida, clique em Relógio Zero e Adquirir no painel de controle do Experimento para iniciar a aquisição de dados. Agora aplique tratamentos nas células de acordo com os requisitos. Quando a aquisição de dados estiver concluída, clique em Pausar para interromper o processo.
Salve os dados adquiridos e prossiga com a análise. Para encerrar o experimento, clique em Arquivo e selecione Fechar Experimento. Por fim, feche o software e transfira todos os dados salvos do computador.
Os queratinócitos primários carregados com a sonda Fura-2 exibiram morfologia celular visível no comprimento de onda de 380 nanômetros. A resposta térmica dos queratinócitos mostrou um aumento na concentração de íons cálcio intracelular durante o aquecimento, com uma resposta semelhante observada durante o resfriamento. A resposta térmica foi abolida nos queratinócitos, sem o gene STIM1 indicando o papel do gene na sinalização térmica do cálcio.
HEK293T células que expressam STIM1 / Orai1 mostraram uma resposta térmica notável após o resfriamento, confirmando a expressão gênica bem-sucedida, conforme evidenciado por marcadores de fluorescência verde e vermelho. A resposta de entrada de cálcio operada por armazenamento nas células que expressam STIM1-Orai1 foi efetivamente induzida por mudanças sequenciais na concentração de cálcio extracelular e edição de ácido ciclopiazônico via profusão. A pipetagem direta da capsaicina, um agonista do TRPV1, desencadeou o influxo extracelular de cálcio nas células que expressam o plasmídeo TRPV1.
