חקרנו את הערוצים שלנו הקשורים לתחושת טמפרטורה, תחושת גיל ותחושת כאב. אנו מתעניינים בסינון פעילויות של מולקולות קטנות בערוצים שלנו ובחקר המנגנונים שלהן. סקרנו שני אגוניסטים מפעילים TRPV1 וערכנו מחקר מפורט על מנגנוני הפעולה שלהם.
טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת, כמותי וסימולטני של שינויי סידן בתאים מרובים, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר. אנו שואפים לחקור את מנגנון הטיפול בתרופות סיניות מסורתיות למחלות השונות באמצעות מודרניזציה של תעלות יונים הקשורות לסידן. כדי להתחיל, להכין שקופיות זכוכית סטרילית בקוטר שמונה מ"מ ומניחים אותם צלחת 24 באר.
הוסף 500 מיקרוליטר של חיץ Poly-D-lycine לכל באר. דוגרים על המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות למשך שעה כדי לאפשר ציפוי. לאחר מכן באמצעות פיפטה, להשליך את תמיסת הציפוי מכל באר.
שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS של Dulbecco והניחו את המגלשות שנשטפו בצד לשימוש מאוחר יותר. זרעו את התאים על צלחת 24 הבארות המוכנה בצפיפות של בערך 1.5 כפול 10 בחזקת 5 תאים לבאר, והניחו את הצלחת באינקובטור עד שהתאים נדבקו. לאחר מכן, ערבבו את תמיסת המניות Fura-2/AM ואת F-127 פלורוני עם החיץ של האנק המכיל יוני סידן 1.3 מילימולרי.
באמצעות רדיד אלומיניום, כסו את פתרון העבודה Fura-2/AM כדי להגן עליו מפני אור. לטיפול מקדים בתאים, העבירו את מגלשות הזכוכית עם התאים לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה את החיץ של האנק. בעזרת פיפטה, יש להשליך את החיץ מכל באר ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ עבודה Fura-2/AM לכל באר.
דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות כדי לאפשר העמסת בדיקה. לאחר מכן הסירו את חיץ העבודה Fura-2/AM מכל באר ושטפו את התאים שלוש פעמים עם החיץ של האנק כדי להסיר עודפי Fura-2/AM. כדי להתחיל, להשיג את התאים שטופלו מראש עבור הדמיית סידן תא בודד ולהתחיל את כל המרכיבים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
פתח את תוכנת ההדמיה הפלואורסצנטית מהאפשרויות הזמינות. בחר את הפרוטוקול הנדרש ולחץ על אישור. לאחר מכן, בחר ניסוי חדש מהתפריט הראשי כדי להתחיל מערך ניסיוני חדש.
כעת, הרכיבו את תא הזילוח על במת המיקרוסקופ והניחו בזהירות את שקופיות התאים המטופלים בפורה-2/AM בתא המכיל את תמיסת החיץ של האנק. כוונן את המיקוד תחת אור לבן לצפייה מיטבית. בחר Focus בלוח הבקרה של הניסוי.
בחר את אורך הגל הרצוי למיקוד כגון 380 ננומטר ולחץ על התחל להתמקד כדי להתחיל התאמות מוקד. התאימו את המיקוד לתאים באמצעות 'מיקוד גס' כדי לקרב את המטרה, ולאחר מכן 'מצא מיקוד' לקבלת התאמות מדויקות. שימו לב לביטוי חלבון המטרה באורכי גל של FITC או TRITC.
לאחר מכן לחצו על 'הפסק מיקוד' וסגרו את חלונית המיקוד. לחץ על הגדר ניסוי בשורת המשימות ובחר את הקומות הרצויות להדמיה בהגדרות התצורה. כעת לחץ על אזור כפתור בשורת התפריטים כדי להגדיר אזורים להדמיה ובחר את סוג התאורה הרצוי להדמיה.
לחץ על רכוש תמונות ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לצלם תמונות. זהה את התאים הרצויים המבטאים את חלבון המטרה תחת פלואורסצנטיות, בהתחשב בקריאה הריקה עם הפקדים מתחת ל -380 ננומטר. כדי לבטל אזור שנבחר, לחץ לחיצה ימנית על העיגול ובחר מחק אזור.
פתח את תפריט הפניות, סמן את התיבה עבור חסר הפניות ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להחיל חיסור רקע. בלוח הבקרה של הניסוי, לחץ על נתוני יומן כדי לתעד את נתוני הניסוי. במקטע Time Lapse בלוח הבקרה, הגדר את מרווח הזמן לרכישת נתונים לשנייה אחת.
לאחר מכן לחץ על שעון אפס ורכישה בלוח הבקרה של הניסוי כדי להתחיל באיסוף נתונים. עכשיו להחיל טיפולים על התאים בהתאם לדרישות. לאחר השלמת איסוף הנתונים, לחץ על השהה כדי לעצור את התהליך.
שמור את הנתונים שנרכשו והמשך בניתוח. כדי לסיים את הניסוי, לחץ על קובץ ובחר סגור ניסוי. לבסוף, סגור את התוכנה והעבר את כל הנתונים השמורים מהמחשב.
קרטינוציטים ראשוניים טעונים בגשושית Fura-2 הציגו מורפולוגיה של תאים גלויים באורך גל של 380 ננומטר. התגובה התרמית של קרטינוציטים הראתה עלייה בריכוז יוני הסידן התוך-תאיים במהלך החימום, עם תגובה דומה שנצפתה במהלך הקירור. התגובה התרמית בוטלה בקרטינוציטים, ללא הגן STIM1 המציין את תפקיד הגן באיתות סידן תרמי.
תאים HEK293T שהביעו STIM1/Orai1 הראו תגובה תרמית בולטת בעת הקירור, ואישרו ביטוי גנים מוצלח, כפי שמעידים סמני פלואורסצנטיות ירוקים ואדומים. תגובת כניסת הסידן בתאים באמצעות ביטוי STIM1-Orai1 נגרמה ביעילות על ידי שינויים רציפים בריכוז הסידן החוץ תאי ובמהדורת חומצה ציקלופיאזונית באמצעות שפע. פיפטינג ישיר של קפסאיצין, אגוניסט TRPV1, גרם לזרם סידן חוץ-תאי בתאים המבטא את פלסמיד TRPV1.
