В течение последнего десятилетия были разработаны модели легкой черепно-мозговой травмы у грызунов с закрытой черепно-мозговой травмой. Тем не менее, применение этих моделей у развивающихся грызунов является редким по сравнению с литературой по ЧМТ у взрослых. Чтобы обеспечить клиническую значимость, в этом исследовании была разработана закрытая черепно-мозговая травма с долгосрочными расстройствами, или модель CHILD TBI.
В течение долгого времени черепно-мозговая травма была сосредоточена на последствиях тяжелых черепно-мозговых травм. В последние два десятилетия сообщалось о легких последствиях ЧМТ, но лишь в немногих исследованиях оценивались долгосрочные последствия. С развитием нейровизуализации растет интерес к долгосрочным результатам, которые отсутствовали в педиатрических моделях.
CHILD был разработан, чтобы заполнить этот пробел. Используя модель CHILD, мы охарактеризовали прогрессивные и стойкие изменения в мозге, такие как гибель нейронов, измененная диффузионная МРТ, измененная активность и пластичность нейронов, увеличение глиоза, прогрессирующие поведенческие возмущения и сердечная дисфункция с возрастом. Преимущество нашей новой модели CHILD заключается в том, что она выполняется и воспроизводима в различных лабораториях.
С широким распространением можно ожидать расширения знаний о долгосрочных последствиях сотрясения мозга у детей. Используя модель CHILD, мы продолжаем исследовать эффекты и последствия повторяющегося стресса. Мы уже начали изучать, как комбинированные эффекты ранней инфекции после рождения и РЕБЕНКА могут способствовать долгосрочным результатам.
Кроме того, мы наблюдаем защиту сосудистого русла после повторного стресса, что позволяет предположить, что после ранней инфекции может иметь место предварительная подготовка, но это требует дальнейшего изучения. Для начала заранее прогрейте камеру для индукции анестезии и восстановительные кейджи, используя согревающие прокладки для предотвращения переохлаждения. Установите стереотаксический аппарат с установленным ударным устройством под углом 90 градусов.
Убедитесь, что все части стереотаксического аппарата правильно затянуты и закреплены. Убедитесь, что поршень плотно ввинчен в ударный элемент. Затем вырежьте алюминиевый лист и оберните стереотаксическую рамку фольгой, чтобы создать подушку, на которой животное будет отдыхать.
Зафиксируйте положение и натяжение фольги с помощью лабораторной ленты, чтобы выдержать вес животного. После этого включите контроллер ударного устройства и отрегулируйте скорость удара до двух метров в секунду для первого класса или трех метров в секунду для второго класса, в зависимости от тяжести травмы. Затем взвесьте животных на весах.
После обезболивания мыши расположите голову мыши под импактором. Убедитесь, что щенок полностью вытянут в длину. Убедитесь, что наконечник ударного элемента диаметром три миллиметра покрыт резиной, чтобы свести к минимуму контакт металла с черепом.
Теперь переключите ручку в положение Extend, чтобы опустить импактор. Примерно опустите ударный элемент, чтобы он располагался между ушами мыши. Затем проведите мышью так, чтобы кончик поршня был перемещен вперед на сумму, эквивалентную длине одного кончика поршня и длине одного кончика слева от животного.
Установите импактор в положение «Втягивание». Затем отрегулируйте положение поршня, чтобы определить тяжесть травмы. Установите время задержки в 0,1 секунды, независимо от тяжести травмы.
Нажмите кнопку Удар на правой ручке, чтобы инициировать удар. Быстро поверните левую ручку в положение Выкл., чтобы предотвратить перегрев системы. Затем поместите мышь на правый бок в клетку для восстановления.
Отслеживайте и записывайте время записи, когда мышь вставает на дыбы на всех четырех ножках. Обратите внимание на время, в течение которого он возобновляет исследовательское поведение. После полного восстановления верните мышь в домашнюю клетку.
Промойте срезы мозга четыре раза по 10 минут каждый в PBS при перемешивании. Перенесите участки мозга в раствор для блокировки и выдержите 10 минут при комнатной температуре. Возьмите разведенные первичные антитела в блокирующем растворе и добавьте участки мозга.
Инкубируйте секции в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации промойте секции четыре раза по 10 минут каждая в PBS при перемешивании. Переложите срезы в блокирующий раствор, содержащий вторичные флуоресцентные антитела, разведенные 1 к 1000, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.
После четырехкратной промывки секций в PBS установите их на слайды с помощью монтажного носителя. Добавьте защитный лист к каждому слайду перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия до получения изображения. Получение иммунофлуоресцентных изображений с помощью эпифлуоресцентного микроскопа и программного обеспечения Micro-Manager.
Самки мышей в группе G2 демонстрировали значительно большее время стояния, чем самцы в той же группе, и оба пола показали более длительное время по сравнению с фиктивной контрольной группой, с большими различиями между уровнями тяжести G1 и G2. Самки мышей в группе G2 показали значительно более длительное время для исследования по сравнению с самцами, и оба пола имели более высокое время по сравнению с фиктивной контрольной группой, со значительным увеличением в зависимости от тяжести между G1 и G2. Астроглиоз, свидетельствующий о повышенном окрашивании глиальных фибриллярных кислых белков, наблюдался в ипсилатеральной соматосенсорной коре группы G2 по сравнению с фиктивным контролем через один день после травмы. Иммуногистохимический анализ NeuN не показал существенной потери нейронов в течение одного дня после травмы.
