Durante la última década, se han desarrollado modelos de traumatismo craneoencefálico leve en roedores con traumatismo craneoencefálico cerrado. Sin embargo, la implementación de estos modelos en el desarrollo de roedores es escasa en comparación con la literatura sobre TCE en adultos. Para abordar con relevancia clínica, este estudio desarrolló un traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo, o modelo de TCE INFANTIL.
Durante mucho tiempo, las lesiones cerebrales traumáticas se han centrado en las consecuencias de las lesiones cerebrales graves. En las últimas dos décadas, se han reportado efectos leves de TBI, pero pocos estudios han evaluado las consecuencias a largo plazo. Con un nuevo desarrollo en neuroimagen, hay un mayor interés en los resultados a largo plazo que han faltado para los modelos pediátricos.
CHILD fue diseñado para llenar este vacío. Utilizando el modelo CHILD, hemos caracterizado cambios progresivos y persistentes dentro del cerebro, como muertes neuronales, resonancia magnética de difusión alterada, actividad neuronal y plasticidad modificadas, aumento de la gliosis, perturbaciones conductuales progresivas y disfunción cardíaca con la edad. Nuestro nuevo modelo CHILD presenta la ventaja de ser realizado y reproducible en diferentes laboratorios.
Con una amplia adopción, podríamos esperar una ampliación en el conocimiento sobre las consecuencias a largo plazo de la conmoción cerebral pediátrica. Utilizando el modelo CHILD, continuamos investigando los efectos y consecuencias del estrés repetitivo. Ya hemos comenzado a investigar cómo los efectos combinados de la infección temprana después del nacimiento y la CHILD pueden contribuir a los resultados a largo plazo.
Además, observamos la protección del lecho vascular después de un estrés repetido, lo que sugiere que puede estar ocurriendo un preacondicionamiento después de una infección temprana, pero esto está a la espera de más investigación. Para comenzar, caliente la cámara para la inducción de la anestesia y las jaulas de recuperación con anticipación usando almohadillas térmicas para evitar la hipotermia. Coloque el aparato estereotáxico con el impactador montado en un ángulo de 90 grados.
Verifique que todas las partes del aparato estereotáxico estén correctamente apretadas y aseguradas. Confirme que el pistón esté firmemente atornillado en el impactador. A continuación, corte una lámina de aluminio y envuelva el marco estereotáxico con papel de aluminio para crear una almohadilla para que el animal descanse.
Asegure la posición y la tensión del papel de aluminio con cinta de laboratorio para soportar el peso del animal. Luego, encienda el controlador del impactador y ajuste la velocidad del impacto a dos metros por segundo para el grado uno o tres metros por segundo para el grado dos, según la gravedad de la lesión. Luego, pesa a los animales en una balanza.
Después de anestesiar el ratón, coloque la cabeza del ratón debajo del impactador. Asegúrese de que el cachorro esté completamente estirado en longitud. Confirme que la punta del impactador de tres milímetros de diámetro esté cubierta con goma para minimizar el contacto del metal con el cráneo.
Ahora, cambie la perilla a la posición Extender para bajar el impactador. Baje bruscamente el impactador, de modo que quede colocado entre las orejas del ratón. Luego, deslice el mouse de modo que la punta del pistón se mueva hacia adelante el equivalente a una longitud de punta de pistón y una longitud de punta a la izquierda del animal.
Coloque el impactador en la posición Retraer. Luego, ajuste la posición del pistón para determinar la gravedad de la lesión. Establezca el tiempo de permanencia en 0,1 segundos, independientemente de la gravedad de la lesión.
Presione Impact en la perilla derecha para iniciar el impacto. Rápidamente, gire la perilla izquierda a la posición de apagado para evitar el sobrecalentamiento del sistema. Luego, coloque el mouse en su flanco derecho en una jaula de recuperación.
Controle y registre el tiempo de escritura cuando el mouse se encabrita sobre las cuatro patas. Observe el momento en que reanuda el comportamiento exploratorio. Una vez que esté completamente recuperado, regrese el ratón a su jaula de origen.
Lave las secciones del cerebro cuatro veces durante 10 minutos cada una en PBS bajo agitación. Transfiera las secciones de cerebro a la solución de bloqueo e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tome los anticuerpos primarios diluidos en la solución bloqueante y agregue las secciones del cerebro.
Incubar las secciones durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lave las secciones cuatro veces durante 10 minutos cada una en PBS bajo agitación. Transfiera las secciones a una solución de bloqueo que contenga anticuerpos fluorescentes secundarios diluidos de 1 a 1000 e incube durante una hora a temperatura ambiente.
Después de lavar las secciones cuatro veces en PBS, móntelas en las guías con un medio de montaje. Agregue una cubierta a cada diapositiva antes de guardarlas a cuatro grados centígrados hasta la adquisición de la imagen. Adquiera imágenes de inmunofluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia y el software Micro-Manager.
Los ratones hembra en el grupo G2 exhibieron un tiempo significativamente más largo para ponerse de pie que los machos dentro del mismo grupo, y ambos sexos mostraron tiempos prolongados en comparación con los controles simulados, con mayores diferencias entre los niveles de gravedad G1 y G2. Los ratones hembra en el grupo G2 exhibieron un tiempo significativamente más largo para explorar en comparación con los machos y ambos sexos tuvieron tiempos más altos en comparación con los controles simulados, con aumentos significativos dependientes de la gravedad entre G1 y G2. La astrogliosis, evidenciada por un aumento de la tinción de proteínas ácidas fibrilares gliales, se observó en la corteza somatosensorial ipsilateral del grupo G2 en comparación con los controles simulados un día después de la lesión. La inmunohistoquímica de NeuN no mostró una pérdida neuronal significativa al día siguiente de la lesión.
