マウスの小児脳震盪モデル:長期障害を伴う閉鎖性頭部外傷(CHILD)

過去10年間で、軽度の外傷性脳損傷のモデルが、閉鎖性頭部損傷のげっ歯類で開発されました。ただし、げっ歯類の開発におけるこれらのモデルの実装は、成体の TBI 文献と比較してまばらです。臨床的関連性に対処するために、この研究では、長期障害を伴う閉鎖性頭部外傷、またはCHILD TBIモデルを開発しました。

長い間、外傷性脳損傷は重度の脳損傷の結果に焦点を当ててきました。過去20年間で、軽度のTBIの影響が報告されていますが、長期的な影響を評価した研究はほとんどありません。ニューロイメージングの新たな発展に伴い、小児モデルに欠けていた長期的な結果への関心が高まっています。

CHILDは、このギャップを埋めるために設計されました。CHILDモデルを使用して、神経細胞死、拡散MRIの変化、神経細胞の活動と可塑性の変化、神経膠症の増加、進行性の行動摂動、加齢に伴う心機能障害など、脳内の進行性および持続的な変化を特徴付けました。当社の新しいCHILDモデルは、さまざまなラボで実施され、再現性があるという利点を提供します。

広く採用されれば、小児脳震盪の長期的な影響についての知識が広がることが期待できます。CHILDモデルを用いて、反復的なストレスの影響と結果について調査を続けています。私たちはすでに、出生後の早期感染とCHILDの複合的な影響が長期的な結果にどのように寄与するかを追求し始めています。

また、ストレスを繰り返した後の血管床の保護が観察され、早期感染後のプレコンディショニングが発生している可能性が示唆されていますが、これはさらなる調査が必要です。まず、麻酔導入用のチャンバーとリカバリーケージを事前に温め、低体温症を防ぐためにウォーミングパッドを使用して温めます。定位固定装置をインパクターを90度の角度で取り付けてセットします。

脳定位固定装置のすべての部品が適切に締められ、固定されていることを確認します。ピストンがインパクターにしっかりとねじ込まれていることを確認します。次に、アルミシートをカットし、脳定位固定装置のフレームをホイルで包んで、動物が休むためのパッドを作ります。

動物の体重を支えるために、実験用テープを使用してホイルの位置と張力を固定します。その後、インパクターコントローラーをオンにし、怪我の重症度に基づいて、衝撃速度をグレード1の場合は秒速2メートルに、グレード2の場合は秒速3メートルに調整します。次に、体重天秤で動物の体重を量ります。

マウスに麻酔をかけた後、マウスの頭をインパクターの下に置きます。子犬の長さが完全に伸びていることを確認してください。インパクター先端がゴムで覆われていることを確認して、頭蓋骨との金属接触を最小限に抑えます。

次に、ノブをExtend位置に切り替えて、インパクターを下げます。インパクターを大まかに下げて、マウスの耳の間に配置します。次に、マウスをスライドさせて、ピストンの先端が動物の左側にピストンの先端の長さ1つ分に相当する量前方に移動するようにします。

インパクターをリトラクト位置に設定します。次に、ピストンの位置を調整して、怪我の重症度を判断します。ドウェル時間を 0.1 秒に設定します(怪我の重症度に関係なく)。

右ノブのインパクトを押して、インパクトを開始します。システムの過熱を防ぐために、左のノブをオフの位置にすばやく回します。次に、マウスを回復ケージの右側に置きます。

マウスが4本の脚すべてで後ずさりしたときの書き込み時間を監視および記録します。探索的動作が再開される時間に注意してください。完全に回復したら、マウスをホームケージに戻します。

攪拌しながら、脳切片をPBSでそれぞれ10分間4回洗浄します。脳切片をブロッキング溶液に移し、室温で10分間インキュベートします。希釈した一次抗体をブロッキング溶液に取り、脳切片を添加します。

切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、撹拌下で切片をPBSでそれぞれ10分間4回洗浄します。切片を1〜1000に希釈した二次蛍光抗体を含むブロッキング溶液に移し、室温で1時間インキュベートします。

切片をPBSで4回洗浄した後、封入剤を使用してスライドにマウントします。各スライドにカバースリップを追加してから、画像を取得するまで摂氏4度で保管します。落射蛍光顕微鏡とMicro-Managerソフトウェアを使用して免疫蛍光画像を取得します。

G2群の雌マウスは、同じ群の雄マウスよりも立っている時間が有意に長く、雌雄ともに偽対照と比較して長時間の時間を示し、G1とG2の重症度レベルの間に大きな差が見られました。G2群の雌マウスは、雄と比較して探索時間が有意に長く、雌雄ともに偽対照と比較して探索時間が長くなり、G1とG2の間で有意な重症度依存性の増加が見られました。グリア線維性酸性タンパク質染色の増加によって証明されるアストログリオーシスは、損傷後1日で偽対照と比較して、G2グループの同側体性感覚皮質で観察されました。NeuN免疫組織化学は、損傷後1日で有意なニューロンの喪失を示さなかった。