У пациентов с диагнозом солидные опухоли молочной железы или поджелудочной железы существует сильная корреляция между событиями прогрессирования заболевания, такими как метастазирование или резистентность к терапии, и плохими исходами. Известно, что клеточные молекулярные механизмы, которые управляют тканевым гомеостазом и фиброзом, также контролируют прогрессирование солидных опухолей. Моя лаборатория заинтересована в понимании этих механизмов, чтобы мы могли лучше разрабатывать методы лечения и диагностические меры для помощи пациентам.
Одна из основных экспериментальных проблем заключается в том, что существует острая потребность в 3D-моделях рака, которые могут фиксировать межклеточные взаимодействия во время физиологических и патофизиологических процессов, а затем, понимая эти взаимодействия, можно получить дополнительное представление о заболеваниях для последующей разработки новых стратегий лечения. Наш протокол обеспечит экономически эффективный и воспроизводимый метод 3D-культивирования клеток, который воспроизводит особенности микроокружения тканей in vivo. Наш протокол обеспечит простые и быстрые методы 3D-культивирования клеток без скаффолдов и на основе скаффолдов, в которых мы сможем количественно оценить гетерогенные клеточные взаимодействия.
Мы обнаружили способ эффективного создания 3D-сфероидальных культур, которые можно использовать с моделями без скаффолдов, но также можно объединить с системами на основе скаффолдов для измерения клеточной инвазии и поведения. Для начала включите ультрафиолетовый свет, чтобы продезинфицировать внутреннюю часть шкафа биобезопасности на 15 минут. Откройте створку окна шкафа биобезопасности, чтобы стабилизировать поток воздуха и включить систему вакуумной аспирации.
Очистите внутреннюю поверхность капота и трубки системы вакуумной аспирации 70% этанолом. Нагрейте питательную среду для клеточных культур, PBS и 0,25% трипсина ЭДТА до 37 градусов Цельсия в ванне с шариками. Теперь исследуйте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить конфлюенцию от 70 до 80%.
С помощью вакуумного аспиратора провести аспирацию и отбросить питательную среду из покрытых клеток. Промойте оставшуюся среду двумя миллилитрами PBS один раз, затем отсадите и выбросьте PBS после промывки. Затем с помощью микропипетки добавьте один миллилитр трипсина в чашку для клеточной культуры и поместите тарелку в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут.
Теперь добавьте один миллилитр ингибитора соевого трипсина в PBS в тарелку, чтобы инактивировать трипсин. Чтобы диспергировать кластеры клеток, пипетируйте жидкую смесь с помощью микропипетки P-1000. Соберите клеточную суспензию со дна пластины и перенесите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте пробирку при 100 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора. Дайте молекулярным флуоресцентным зондам нагреться до комнатной температуры в течение 15 минут в ванне с шариками, температурой 37 градусов Цельсия. С помощью микропипетки ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах соответствующих рабочих растворов красителей для отслеживания клеток.
Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом. После 30 минут инкубации центрифугируйте пробирки при 100 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем используйте вакуумный аспиратор для аспирации и удаления надосадочной жидкости.
Тщательно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 10%FBS-содержащего DMEM с помощью микропипетки. Теперь соберите 10 микролитров клеточной суспензии и перенесите ее в микропробирку, содержащую равный объем трипанового синего. После смешивания клеток добавьте 20 микролитров раствора трипана клеток в предметное стекло камеры подсчета клеток.
Вставьте предметное стекло в автоматический счетчик ячеек, чтобы определить номер ячейки. Рассчитайте среднее общее количество живых клеток по двум показаниям. Готовят рабочие клеточные запасы для каждого типа клеток в концентрации 6,67 умножить на 10 в степени трех клеток на миллилитр, что эквивалентно 2000 клеток на 300 микролитров.
С помощью микропипетки перенесите в микропробирку необходимый объем для трех технических повторов плюс один дополнительный. После тщательного перемешивания пипеткой переложите 300 микролитров образца в лунку-образного дна сверхнизкого крепления 96-луночного микропланшета. Поместите планшет на 96 лунок в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия.
Визуализируйте рост и морфологию сфероидов каждые 24 часа, до 96 часов, с помощью фазово-контрастного микроскопа. Включите устройства визуализации и автоматизированные устройства инкубатора. Создайте новый протокол визуализации в диспетчере задач программного обеспечения для визуализации, чтобы зафиксировать 48-часовой рост сфероидов BT-474, культивируемых совместно с фибробластами BJ-5ta, и эндотелиальных клеток EA.hy926, окрашенных красителями клеточного трекера в синий, оранжевый и темно-красный цвета соответственно.
Наполните ведро со льдом льдом, чтобы раствор экстракта базальной мембраны оставался холодным, и поместите раствор на лед. С помощью многоканальной пипетки отасуньте примерно 170 микролитров среды из чашки для культивирования. Приобретите увеличительное стекло и мини-световой короб, чтобы внимательно наблюдать за маленькими сфероидами.
Поместите 96-луночную сфероидальную пластину над световым коробом и расположите увеличительное стекло над головой. Установите дозатор P-200 на 30 микролитров и соберите экстракт базальной мембраны, чтобы создать три микрокапли. Убедитесь, что 96-луночный планшет плоский, и расположите пипетку вертикально над сфероидом.
Теперь выпустите каплю, не касаясь дна лунки. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. После инкубации насыпьте на сфероиды еще 50 микролитров раствора экстракта базальной мембраны на лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем с помощью микропипетки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров среды для клеточных культур. Через 72 часа после осаждения клетки MCF-10A, MCF-10Ca1H и BT-474, совместно культивируемые с EA.hy926 и THP-1 или с BJ5-ta и THP-1, продемонстрировали значительное увеличение площади сфероидов по сравнению с монокультуральными эпителиальными сфероидами. Напротив, ко-культивируемые клетки MDA-MB-468 показали значительное уменьшение площади сфероидов по сравнению с монокультурой.
Применение клеточного трекера к опухолевым эпителиальным клеткам BT-474 и стромальным клеткам до формирования сфероидов показало, что стромальные клетки, включая EA.hy926 и BJ-5ta, образовывали почковающиеся структуры по периметру центральных сфероидов BT-474. Через 24 часа после нанесения базальной мембраны на опухолевые эпителиальные клетки BT-474, совместно культивируемые со стромальными клетками, была наложена базальная мембрана, что продемонстрировало образование инвазивных структур.
