Клетки HC11 и EpH4 являются линиями эпителиальных клеток молочной железы мыши, которые могут различаться в культуре. В то же время, эти клетки могут быть преобразованы рядом онкогенов. Эти клетки идеально подходят для изучения взаимосвязи между дифференциацией и неопластической трансформацией.
Эти методы могут быть использованы в исследованиях трансдукции сигнала, чтобы обнаружить цели для терапии рака. Например, небольшой GTPase Rac и другие молекулы могут вызвать трансформацию эпителиальных клеток молочной железы при выраженных до высоких уровней, но удивительно на низких уровнях, они могут вызвать дифференциацию. Другие превью сигнала могут вести себя аналогичным образом.
Принципы могут применяться к другим видам дифференциации, а также, где слияние клеток играет важную роль, например дифференциации адипоцитов или миотрубов. Кто-то выполняет этот метод в первый раз следует иметь в виду, что покрытие клеток HC11 имеет важное значение. Это потому, что контакт от клетки к клетке имеет важное значение для дифференциации.
Еще один момент, чтобы следить за тем, что надлежащее извлечение клеток EpH4 из матрицы имеет решающее значение для количественной оценки белка, потому что любые остатки будут влиять на определение белка. Визуальная демонстрация этого метода полезна, поскольку некоторые детали протокола трудно описать на бумаге. Начните с подготовки бутылки из 50 миллилитров клеточной среды HC11 в соответствии с рукописными указаниями.
Чтобы пластины клеток, аспирировать среды от пяти шести сантиметров 50% confluent Петри блюда и мыть клетки с примерно 1,8 миллилитров трипсина с помощью стерильных девять дюймов хлопка подключен Пастер пипетки. Затем добавьте 200 микролитров трипсина на тарелку и закружить пластину, чтобы выбить прикрепленные клетки. Наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопией с целью 4X, чтобы убедиться, что они начали вытеснять.
Затем аспирировать примерно 1,5 миллилитров HC11 среды со стерильным девять дюймов Пастер пипетки и шприц его вертикально против клеток, вращая блюдо убедившись, чтобы избежать брызг. Перенесите все клетки в бутылку со средним HC11 и вихрем, чтобы равномерно разойтись в бутылке. Затем aliquot клеточной подвески в 20 трех сантиметров Петри блюда путем трубопроводов два миллилитров клеток на блюдо.
Рок Петри блюда для распространения клеток и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в одночасье. На следующий день, когда клетки на 90-100% стекут, аспирировать среду и заменить ее средой с FBS, но без EGF. После выращивания клеток в среде без EGF в течение 24 часов, добавить дифференциации среды до 10 блюд и расти клетки до 10 дней, сохраняя другие 10 блюд в качестве контроля.
Изменение среды каждые два-три дня как с HIP лечение и контрольных клеток. Чтобы контролировать дифференциацию, наблюдайте за клетками с фазовой контрастной микроскопией. Используйте микроскопию флуоресценции, если клетки выражают зеленый флуоресцентный белок.
Кроме того, количественно степень дифференциации путем извлечения белков из HIP лечение и контроль клеток один раз в день и выполнения западного анализа пятно. Соберите и поместите среду роста EpH4, матрицу EHS и две конические 50 миллилитровые трубки на льду. Prechill ткани культуры пластин с пипеткой советы при температуре минус 20 градусов по Цельсию и подготовить EpH4 среднего роста дополняется 10 или 20%matrix в двух 50 миллилитров конических труб и держать их на льду до готовности к использованию.
После извлечения предварительно облицованной ткани культуры пластин при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пальто 10 скважин 24-хорошо пластины с 150 микролитров неразбавленной матрицы путем распространения матрицы с пипеткой. Избегайте создания пузырьков при распространении матрицы. Затем осторожно коснитесь стороны пластины и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы матрица затвердеть.
Между тем, подготовиться к дифференциации путем трипсинизации клеток EpH4, а также ранее описанных и обеспечения одноклеточных суспензий после повторного незаменимия трипсинизированных клеток. Далее подсчитайте клетки в подвеске с гемоцитометром. Передача пять раз 10 до четырех клеток на колодец в 1,5 миллилитров стерильной конической центрифуги трубки и спина их в 250 раз г в течение пяти минут.
Тщательно аспирировать супернатант среды и поместить трубку на лед. Используйте один миллилитровый наконечник пипетки, чтобы повторно использовать клетки в 350 микролитров epH4 среды роста дополняется 20%матрицы, сохраняя трубы на льду убедившись, чтобы избежать пузырьков. После того, как нижний слой затвердеет, добавьте 350 микролитров клеточной подвески к каждому покрытой хорошо и поместите его в инкубатор двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы 20%-матричный слой затвердеть.
Наблюдайте за клетками с фазовой контрастной микроскопией, чтобы убедиться, что отдельные клетки видны. Затем добавьте 200 микролитров среды EpH4 с 10%матрицей сверху и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию. Начните индукцию дифференциации через день после покрытия клеток в матрице.
Аккуратно удалите 150 микролитров верхней 10%матрицы среды и добавьте 200 микролитров среды EpH4, содержащих HIP и 10%matrix, а для элементов управления добавьте 10%-среду без HIP. Замените носитель каждые два дня на срок до 10 дней, отслеживая образование маммосферы фазовой контрастной микроскопией. Для количественной оценки дифференциации, тщательно пипетки от 10%матрицы HIP среды из скважин и промыть 20%матричный слой с 350 микролитров ледяной PBS.
Затем добавьте от 70 до 100 микролитров ледяного PBS с одним миллимолярной ЭДТА непосредственно в скважины и аккуратно отсоедините нижний слой 100%-процентной матрицы кончиком пипетки. Встряхните тарелку осторожно при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Тщательно перенесите суспензию сфероида в коническую трубку и промойте скважины 500 микролитров PBS EDTA, чтобы восстановить оставшиеся сфероиды.
Рок трубки на льду в течение еще 30 минут убедившись, что матрица полностью растворяется. Если видные сгустки матрицы видны, добавить больше PBS EDTA или встряхнуть дольше. Центрифуга раствора в 350 раз г гранулировать сфероиды.
Затем аспирировать супернатант, лизировать сфероиды, и зондировать клетки для бета-кейсина, циклина D1, и p120RasGAP западным blotting. Существует поразительная зависимость дифференциации от силы сигнала Rac в клетках HC11. В то время как эндогенный CRAC1 необходим для дифференциации и низкие уровни мутационно активированного RacV12 вызывают увеличение дифференциации, высокие уровни RacV12 вызывают блок дифференциации и вызывают неоплазию.
Когда свойства дифференциации клеток EpH4 были исследованы в культуре 3D матрицы, было установлено, что производство бета-кейсина достигло пика в 8-10 дней, а экспрессия циклина D1 была максимальной через четыре-шесть дней после стимуляции HIP. Чтобы определить позиционирование отдельных клеток, они были окрашены DAPI и изображены с конфокальные микроскопии. Внутренняя гибель клеток и образование полых люменов наблюдалось в маммосферах, а добавление HGF приводило к образованию трубчатых структур.
Кто-то выполняет этот метод в первый раз следует иметь в виду, что покрытие клеток HC11 имеет важное значение. Также правильное извлечение клеток EpH4 из матрицы имеет решающее значение для количественной оценки белка, потому что любые остатки повлияют на определение белка. Этот метод может быть использован для исследования других превью сигнала, которые могут вести себя аналогичным образом.
Если есть мутации драйвера в раке, то их полное ингибирование не будет необходимости, так как низкие уровни, оставшиеся на самом деле вызовет дифференциацию.
