In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in lebenden Drosophila Embryonen. Die Embryonen werden in Agar eingebettet und zentrifugiert. Diese Technik liefert reproduzierbare Trennung von wichtigen Organellen entlang der anterior-posterior Embryo-Achse. Diese Methode erleichtert die Kolokalisation Experimente und liefert Organelle Fraktionen für die biochemische Analytik und Transplantation Experimente.

Zusammenfassung

Eine wichtige Strategie zur Reinigung und Isolierung verschiedener intrazellulären Organellen ist, sie voneinander zu trennen basierend auf Unterschieden in Schwebedichte. Allerdings, wenn die Zellen vor der Zentrifugation, Proteinen und Organellen in dieser nicht-native Umgebung gestört werden oft fälschlicherweise aneinander kleben. Hier beschreiben wir eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in intakten, lebenden Drosophila-Embryos. Frühe Embryonen vor Zellularisierung sind aus Käfigen Bevölkerung geerntet, und ihre äußeren Eierschalen werden durch Behandlung mit 50% Bleichmittel entfernt. Die Embryonen werden dann zu einem kleinen Agarplatte und eingefügt, hinteren Ende zuerst, in kleinen vertikalen Löcher in den Agar übertragen. Die Platten mit eingebetteten Embryonen werden für 30 min bei 3000g zentrifugiert. Der Agar unterstützt die Embryonen und hält sie in einer definierten Orientierung. Anschließend werden die Embryonen aus dem Agar mit einer stumpfen Nadel gegraben.

Zentrifugation trennt wichtigsten Organellen in verschiedene Schichten, eine Schichtung gut sichtbar von Hellfeld-Mikroskopie. Eine Reihe von fluoreszierenden Markern zur Verfügung stehen erfolgreiche Schichtung in lebenden Embryonen zu bestätigen. Proteine ​​mit bestimmten Organellen assoziiert wird in einer bestimmten Schicht angereichert werden, zeigt Kolokalisation. Einzelne Schichten können zur biochemischen Analyse oder Transplantation in gespendeten Eizellen gewonnen werden. Diese Technik ist für Organelle Trennung in anderen großen Zellen, einschließlich der Eier und Eizellen von verschiedenen Arten.

Protokoll

1) Vorbereiten Agarplatten

Übersicht: Dieses Protokoll beschäftigt Agarplatten für zwei verschiedene Anwendungen. Erstens dienen die Agarplatten als Eiersammlung Oberfläche; Apfelsaft in der Agar stimuliert die Eiablage. Zweitens sind Embryonen im Agar eingebettet in eine feste Orientierung statt, wenn die Platten zentrifugiert werden; eine ausreichend hohe Konzentration von Agar ist notwendig, um die Platten vor der Auflösung während der Zentrifugation zu vermeiden. Der Einfachheit halber ist eine einzige Art von Apfelsaft-Agar für beide Zwecke eingesetzt werden.

Materialien

• Agar (25 g)
• Saccharose (25 g)
• Apfelsaft (250 ml)
• Nipagin M Stammlösung (5 g Methyl-p-Hydroxy-benzoat in 50 ml Ethanol), wirkt als Konservierungsmittel
• Petrischalen: für die Zentrifugation (60x15mm) und für Ei-Sammlung (60x15 mm oder 100x15 mm, abhängig von der Fliege Käfige in Schritt 2 verwendet)

Ausstattung

• Herdplatte
• Zwei Erlenmeyerkolben

1. In einem Erlenmeyerkolben kombinieren 25 g Agar und 750 ml dH ₂ O. Autoklaven für 50 min auf liquide Zyklus. In der Zwischenzeit bereiten Apfelsaft-Lösung (Schritt 1,2).
2. In einem weiteren Erlenmeyerkolben kombinieren 25 g Saccharose und 250 ml Apfelsaft. Hitze auf heißer Platte (auf etwa 55 ° C) zu Saccharose aufzulösen. Dann fügen Sie 15 ml Nipagin M Lösung. Vermeiden Sie höhere Temperaturen, wie sie verursacht Nipagin zu brechen.
3. Sobald der Agar-Lösung abgekühlt ist genug, dass die Flasche von Hand gehandhabt werden können, kombinieren die beiden Lösungen und gründlich mischen. Stir auf einer Heizplatte, bis es gleichmäßig gemischt.
4. Lösung in den leeren Petrischalen (~ 0,5 cm hoch). 1 Liter Lösung reicht für etwa 100 kleine (60 mm Durchmesser) oder 40 große (100 mm Durchmesser) Gerichte.
5. Agar-Platten sollten für mehrere Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, sonst werden sie zu nass für den Einsatz. Für die langfristige Lagerung, halten sie verpackt (in Kunststoff-Behälter oder eine Petrischale Ärmel) bei 4 ° C.

2) Die Ernte Embryonen

Übersicht: Während der ersten 3 Stunden nach der Entwicklung (bei ​​Raumtemperatur), sind Drosophila Embryonen einzelne Zellen (nicht mitgerechnet die Keimbahn-Vorstufen, die hinten gelegen Pol-Zellen). Wenn richtig ausgerichtet Embryonen dieser Stadien zentrifugiert werden, die wichtigsten Organellen getrennt durch die Dichte entlang der Längsachse des Eies. Am Zellularisierung Bühne, ist diese große Zelle in Tausende von kleinen Zellen umgewandelt, die mit Zentrifugalkräften beschäftigt nicht brechen diese Zellen. Für eine erfolgreiche Trennung von wichtigen Organellen, ist es daher von entscheidender Bedeutung, um Embryonen, die noch nicht abgeschlossen Zellularisierung Zentrifuge.

Materialien

• Apfelsaft-Agar-Platten
• Hefe-Paste (Trockenhefe mit Wasser zu Erdnuss-Butter Konsistenz gemischt)

Ausstattung

• Fly Käfige: im Handel erhältlich (siehe unten) oder zu Hause entwickelter ¹

1. Adult Fliegen sind in Käfigen, auf die Apfelsaft-Agar-Platten an der Unterseite angebracht gehalten werden. Verwenden einer Größe von Petrischalen geeignet für die Käfige im Einsatz.
2. Zur Einleitung ein Ei Sammlung, bereiten Sie einen frischen Apfelsaft-Agar-Platte und decken einen Teil mit Hefe einzufügen. Fruchtfliegen essen Hefe, insbesondere bietet Hefeernährung für die Eiererzeugung. Die Anwesenheit von Hefe-und Apfelsaft im Agar induziert auch die Eiablage.
3. Zum Austausch der alten mit der neuen Agarplatte, ist die Fliege Käfig invertiert und schlug auf der Tischplatte ein paar mal. Die Fliegen werden auf den Boden sinken und werden kurz desorientiert. Das gibt Ihnen ein paar Sekunden, um schnell entfernen Sie eine Agar-Platte und ersetzen Sie ihn durch einen neuen. Dieser Austausch erfordert einige Übung und Details hängen von der Art des Käfigs beschäftigt.
4. Weibliche Fliegen speichern Spermien aus früheren Verpaarungen in internen Beutel (spermathecae), aus denen Spermien freigesetzt Befruchtung von Eiern zu ermöglichen. Als gut gefüttert und ungestört, legen die Weibchen Eier kurz nach der Befruchtung und damit die Zeit der Eiablage markiert den Zeitpunkt der Befruchtung und der Anfang der Entwicklung. Wenn die Bedingungen nicht optimal sind, halten Weibchen befruchtete Eier für variable Zeiten vor der Verlegung. Zur Minimierung der Anzahl solcher falsch inszeniert Embryonen, ist es ratsam, die erste Kollektion des Arbeitstages ("Pre-Kollektion" von 30 bis 60 min ist ausreichend) zu verwerfen. Die Anwesenheit der frische Hefe induziert die Weibchen, um diese statt Eier zu legen, und die anschließende Ei Sammlungen neigen dazu, durch Eier dominiert hinterlegt kurz nach der Befruchtung.
5. Sammle Eier für bis zu 3 Stunden, je nachdem, welche Embryonalstadium gewünscht ist. Da bei Raumtemperatur Zellularisierung nach ~ 3,5 Stunden abgeschlossen ist, werden mehr Abholzeiten nicht sinnvoll. Die meisten konsequente Schichtung ist bei jungen Embryonen erreicht, so dass für Routine-Experimente, die wir für kürzere Abholzeiten (1 hroder weniger).
6. Manchmal fliegt zu bekommen, um die Hefe oder an der Oberfläche der Agarplatte stecken. Entfernen Sie sie mit einer Pinzette.

3) Entfernen der Eierschale aus den Embryonen

Übersicht: einer äußeren Schicht (Chorion) von Protein und einer inneren Schicht aus (Dotterhaut) überwiegend aus Wachs: Drosophila Embryonen werden durch zwei Schutzschichten abgedeckt. Sie schützen den Embryo vor mechanischen Beleidigungen und Austrocknung. Das Chorion hat zwei Erweiterungen (das Ei Fäden oder Rückenanhänge), die gut sichtbar im Unterschied Strukturen sind. In diesem Schritt werden wir das Chorion durch Einweichen die Eier in 50% Bleichmittel entfernen. Sobald das Chorion entfernt wird, wird der Embryo im Durchlicht transparent, so dass die Auswahl spezifischer Embryonalstadien für die Zentrifugation. Wie das Chorion würde auch mit vielen post-Zentrifugation Verfahren (zB Fixierung in Schritt 6) eingreifen, die Entfernung des Chorion nun schnelle Bearbeitung später ermöglichen.

Die 50% Bleichmittel behandelt wird das Chorion in wenigen Minuten zu lösen, aber es schadet nicht der Embryo. Die Dotterhaut hält die ausbleichen. Wir werden weiterhin das Bleichmittel behandelt, bis das Ei Filamente nicht mehr sichtbar sind. Danach werden wir die Embryonen aus der Bleiche getrennt, indem man das Embryo / Bleiche Aufschlämmung durch ein winziges Sieb (ein Korb aus Drahtgitter). Es ist entscheidend, nicht das Bleichmittel Exposition Schritt überstürzen. Wenn das Bleichmittel wird vorzeitig, späteren Schritten gewaschen (zB Entfernung der Dotterhaut folgenden Fixierung) gefährdet sein könnte.

Materialien:

• Squirt Flasche mit 50% Bleichmittel (ein Volumen dH ₂ O zu einem Volumen handelsübliche Bleiche)
• Spritzflasche mit dH ₂ O
• Papierhandtuchspender

Ausstattung:

• Hausgemachte Drahtkörbe gestellt von Blatt Edelstahl-Drahtgeflecht. Um Körbe, geschnitten Quadrate ~ 2 x 2 cm aus dem flachen Bogen und Gedankenstrich sie in der Mitte.
• Pinzette zu halten Drahtkörbe
• Präpariermikroskop für Durchleuchtung eingestellt

1. Legen Sie die Agar-Platte unter einem Binokular und beobachten Sie die Embryonen durch Durchleuchtung. Vergewissern Sie sich, um das Ei Filamente zu identifizieren (siehe Abbildung 2A).
2. Squirt 50% Bleichmittel auf die Agar-Platte, für die Embryonen. Man schüttelt die Agarplatte gelegentlich zu wirbeln die Embryonen etwa in der Bleiche.
3. Sobald das Ei Filamente nicht mehr (in der Regel nach 3-5 min, aber die Zeiten können variieren) sichtbar ist, hat das Chorion wurde erfolgreich entfernt.
4. Im nächsten Schritt wird ein Drahtgeflecht Warenkorb als Sieb verwendet werden, um die Embryonen aus der Bleiche zu trennen. Besorgen Sie sich die Drahtkorb mit einer Pinzette und halten ihn über den invertierten Abdeckung der Agarplatte. Der Deckel wird als Reservoir dienen dazu, die Bleiche tropft durch das Drahtgeflecht zu fangen.
5. Gießen Sie die Bleiche / Embryo Schlamm aus der Agarplatte durch das Drahtgeflecht.
6. Wenn eine signifikante Anzahl von Embryonen bleiben auf der Agarplatte, spritzen dH ₂ O auf den Teller und gießen Sie die dH ₂ O / Embryo Schlamm durch das Drahtgeflecht. Wenn eine signifikante Anzahl von Embryonen übergreifen in das Reservoir, gießen Sie den Inhalt Reservoir durch das Drahtgeflecht.
7. Berühren Sie die Unterseite des Drahtgeflecht zu einem Papiertuch zu tilgen entfernt überschüssige Flüssigkeit. Dann spritzen dH ₂ O auf das Drahtgeflecht abzuspülen verbleibenden Bleichmittel. Wie oben beschrieben, kann die Abdeckplatte als Reservoir verwendet werden, um alle Embryonen versehentlich abgewaschen erholen. Sie können zu minimieren verlieren Embryonen, indem der Strom von Wasser aus der Spritzflasche entlang des Umfangs der Drahtkorb. Häufig abtupfen überschüssige Flüssigkeit.
8. Wiederholen Sie diesen Waschschritt fünf vor zehn Mal, bis alle Bleiche entfernt worden ist. Wenn der Drahtkorb riecht noch nach Bleichmittel, sollte Waschen fortzusetzen.

4) Montage Embryonen in Agar

Übersicht: Drosophila Eier sind viel länger (~ 500 pm) als breit (~ 180 um). Um maximale und die konsequente Trennung von Organellen während der Zentrifugation zu erhalten, orientieren wir Embryonen, so dass ihre vorderen Enden weisen auf den Drehpunkt (Abb. 1, 3). Auf diese Weise reichern sich die leichteste intrazellulären Strukturen (Fetttröpfchen) am vorderen Ende in alle Embryonen, während sehr dichte Strukturen (Dotter-Komponenten) in der Nähe des hinteren Endes zu akkumulieren. Die Embryonen werden in kleine senkrechte Löcher in Apfelsaft-Agar eingesetzt, wobei die vorderen Enden ragten. Der Agar hält den Embryo in eine feste Orientierung während der Zentrifugation.

Ausstattung:

• Nadelhalter
• Tungsten Nadeln, die Nadeln werden in die Halterung nach hinten von der typischen Ausrichtung montiert, so dass das stumpfe Ende aus Stöcken und ist verfügbar, um die Embryonen zu manipulieren
• P200 Pipette
• Präpariermikroskop für transilluminatio gesetztn
• Fly Bürste (kleine Pinsel zur Behandlung von erwachsenen Drosophila Art)

Materialien:

• Triton Salt Solution (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml Triton X-100, zu füllen mit ddH ₂ O auf 1000 ml (kann als 10x-Stammlösung hergestellt werden)

1. Wash Embryonen aus dem Drahtkorb mit TSS und in eine leere Petrischale. Die Embryonen sollten auf den Boden sinken. Übertragen Sie die Petrischale mit den Embryonen in TSS auf ein Binokular und beobachten durch Durchleuchtung (Embryonen wird ähnlich aussehen wie in Abbildung 4 dargestellt).
2. Mit einer Pipette P200, wählen Embryonen der gewünschten Stufen und sie auf eine kleine Agarplatte. Spezifische Stufen können leicht visuell erkannt werden (Abbildung 4; für weitere Details, siehe ^1). Arbeiten Sie schnell, da Embryonen Alterung und längerem Eintauchen (länger als 30 min) in TSS kann die Entwicklung beeinflussen.
3. Entfernen Sie die meisten TSS mit einer Pipette und eine Kimwipe. Die Oberfläche des Agar sollte leicht feucht, das macht es einfacher, Embryonen herumschubsen. Allerdings sollte es nicht Pools verbliebene Flüssigkeit irgendwo auf der Platte, da überschüssige Flüssigkeit während der Zentrifugation bewirkt, dass die Embryonen zu rutschen aus den Löchern werden.
4. Mit einer Nadel, poke vertikale Löcher in den Agar in der Nähe, wo ein Embryo befindet. Es ist schwer, Löcher, die perfekt senkrecht stehen Sack, weil man die Nadel in einem Winkel halten zu können, gleichzeitig unter dem Mikroskop zu sehen sind. Eine geringfügige Neigung der Nadel ist sogar von Vorteil, weil dies schafft eine leichte Depression / Hain auf der einen Seite des Loches so dass der Embryo wird einfach entlang und in das Loch gleiten. Es ist ausreichend, um die Punktion der Oberfläche des Agar-Agar, da die weich genug ist, dass einmal ein Embryo teilweise in ein Loch in weiter ohne Schaden geschoben werden können eingefügt.
5. Vergewissern Sie sich, erkennen Sie die vorderen und hinteren Ende des Embryos, da die Embryonen in die Löcher in der konsequenten Ausrichtung geschoben werden sollte, in der Regel mit dem vorderen Ende. Die Dotterhaut am vorderen Ende wird durch eine spezielle Struktur gekennzeichnet, die Mikropyle (Abbildung 2), durch die die Spermien bei der Befruchtung tritt.
6. Mit dem stumpfen Ende der Nadel, können Sie gegen den Embryo drücken, um es an den Agar zu bewegen und zu orientieren / Manöver ihrem hinteren Ende in Richtung einer punktierten Loch. Dann gegen das vordere Ende Vorstoß in Richtung der Bohrung. Dies sollte leicht gleiten die Embryos in das Loch entlang der leichten Depression beim Durchstechen generiert. Da der Embryo kippt nach oben, schieben Sie sie tiefer in das Loch.
7. Wenn es vollständig eingedrückt wird der Embryo in der Regel schon ziemlich senkrecht. Wenn nicht, können Sie das eingefügte Embryo mehr vertikal ausrichten, indem Sie auf sie seitlich. Wenn das Loch nicht zu groß ist, wird der Embryo Position stabil durch das Agar in Zentrifugation statt.
8. Mit etwas Übung ist es möglich, 100-250 Embryonen pro Platte einbinden. Es wird von der jeweiligen Anwendung, wie viele benötigt werden abhängig: Wenn Embryonen für Live-Aufnahmen oder als Spender für die Transplantation Versuche verwendet werden, nur wenige sind erforderlich. Wenn Embryonen zu Festnetz-und immungefärbt werden sollen, wird ein Bruchteil in der Post-Zentrifugation Verarbeitung verloren, und man muss mit höheren Zahlen zu beginnen. Beachten Sie, dass Embryonen während der Montage so, wenn eine enge Entwicklungsphase gewünscht ist, die gesamte Zeit bei der Montage muss immer zu kurz sein weiterentwickeln.
9. Wenn es irgendwelche Embryonen übrig, die nicht eingebettet wurden, entfernen Sie sie von der Platte mit einem feuchten Pinsel zu fliegen. Dip-the-fly Pinsel in Flüssigkeit (zB 1xTSS), sorgfältig über die Oberseite der Platte wischen (beim Betrachten unter dem Binokular) zu fegen alle übrig gebliebenen Embryonen, und waschen Sie die Embryonen aus der Bürste durch Eintauchen des Pinsels in die Flüssigkeit wieder.

5) Die Zentrifugation und Gewinnung von Embryonen

Übersicht: Die Platten sind zum Schwingen Eimern einer Sorvall RT7 Plus Zentrifuge überführt und zentrifugiert für 30 min bei 4000 rpm, die ~ 3000 g. entspricht Nach der Zentrifugation werden die Platten mit TSS abgedeckt. Mit einer Nadel werden Embryonen aus den Löchern in den Agar gegraben und verlegt in geeignete Gefäße über eine Pipette.

Ausstattung:

• Nadelhalter mit Nadel (wie bisher)
• Sorvall RT7 Plus mit RTH750 Rotor und schwingenden Eimer, oder gleich ²
• Präpariermikroskop für Durchleuchtung eingestellt
• P200 Pipette

Materialien:

• TSS

1. Transfer-Platten zu schwingen Eimer der Zentrifuge, Agar nach unten. Stellen Sie sicher, Zentrifuge gleichmäßig ausgewogen ist.
2. Einstellungen für die Zentrifugation: Temperatur = 4-10 ° C, Drehzahl n = 4000, = 30 min.
3. Nach der Zentrifugation Ort Agarplatte unter dem Binokular wieder und die Platte abgedeckt mit einer Schicht von TSS.
4. Mit dem bLunt Ende der Nadel, graben die Embryonen aus ihren Löchern. Sie werden in TSS float, sondern bleiben unter Wasser.
5. Embryonen erscheint offensichtlich geschichtet, mit einer braunen Kappe am vorderen Ende eine klare mittleren Bereich, und eine dunkle, graue Fläche am hinteren Ende (Abbildung 2, 5A). Discard Embryonen, die zu deutlichen Schichtung zeigen, scheitern.
6. Mit einer Pipette P200, übertragen Sie die gut geschichteten Embryonen in TSS in ein neues Gefäß, zB ein Szintillationsfläschchen oder Mikrozentrifugenröhrchen, je nach Anwendung.

6) Die weitere Verarbeitung

Je nach Anwendung werden Embryonen anschließend auf verschiedene Weise behandelt werden.

1. Für die direkte Beobachtung von Hellfeld-oder Epifluoreszenzmikroskopie sind Embryonen im Puffer auf einen Objektträger übertragen und montiert unter einem 22x22 mm # 1.5 Deckglas, mit 18x18 mm Nr. 1 Deckgläser als Abstandshalter. Für Langzeitbeobachtungen, kann es notwendig sein, um den Puffer mit Halocarbonöl 27 zu ersetzen.
2. Wenn Embryonen zu befestigen sind, sollten sie in Schritt 5,6 bis ein Szintillationsfläschchen übertragen werden. Sie können dann fixiert unter Verwendung von Standard Fixationstechniken ¹ sein. Diese Techniken typischerweise Rühren in einer Heptan-Methanol-Emulsion, die Dotterhaut zu entfernen. Beachten Sie, dass für zentrifugiert Embryonen die Effizienz dieser devitellinization Schritt niedrig ist. Es ist daher ratsam, mit so vielen Embryonen als praktische starten oder die Dotterhaut manuell ^{1 zu} entfernen.
3. Wenn Embryonen in der Transplantationsmedizin Experimente (z. B. zu einem bestimmten Organellen Schicht von der zentrifugiert Embryonen zu entfernen) verwendet werden, sind sie auf Agarplatten übertragen und montiert auf Deckgläsern, unter Verwendung von Standardverfahren für unzentrifugierten Embryonen ^3. Die Schichtung durch Zentrifugation induziert wird für zehn Minuten stabil.

7) Repräsentative Ergebnisse

Wenn die Zentrifugation wie erwartet funktioniert, wird die große embryonalen Organellen Art von Dichte ^2. Zum Beispiel wird der Low-Density-Lipidtröpfchen am vorderen Ende ansammeln, die mit hoher Dichte Eigelb Vesikel wird am hinteren Ende (Abbildung 1, 2) zu akkumulieren. Fetttröpfchen und Eigelb Vesikel Lagerung Organellen für Lipide und Proteine.

Bestätigung der Dichte-abhängige Schichtung erfolgt über visuelle Inspektion der lebenden Embryonen durch Durchleuchtung unter einem sezieren oder zusammengesetzte Mikroskop erreicht. Die Embryonen, wie in Abbildung 5A erscheinen: Die Lipid-Tröpfchen wird eine solide braune Schicht an der sehr vorderen Spitze (eine "Lipid-cap") bilden; Eigelb Akkumulation in einer dunkelgrauen Zone am hinteren Ende führen. Diese beiden dunklen Schichten sind durch eine breite klare Zone, die anderen Organellen und Cytoplasma stellt getrennt. Wenn Embryonen nach Zellularisierung werden zentrifugiert, wird Schichtung minimal sein (Abbildung 5C).

Wenn ein Epifluoreszenzmikroskop verfügbar ist, können diese lebenden, zentrifugiert Embryonen unter UV-Anregung untersucht werden. Unter diesen Bedingungen zeigt das Eigelb intensive blaue Autofluoreszenz (Abbildung 5B). Eine kompakte Schicht aus autofluoreszierenden Material am hinteren Pol zeigt die erfolgreiche Zentrifugation und dient als Marker für das hintere Ende.

Beachten Sie, dass das Erscheinungsbild dieser Schichten drastisch ändern, wenn die Embryonen fixiert sind. Zum Beispiel, wenn Embryonen, die durch Standard-Wärme-oder Formaldehyd Fixierung sind fest von Heptan-Methanol devitellinization ¹ gefolgt, werden die Fetttröpfchen durchscheinend und die Lipidschicht erscheint weißlich und flauschige durch helles Licht-Mikroskopie, anstatt dunkelbraun (Abb. 5D). Yolk Autofluoreszenz ist teilweise oder vollständig durch Fixierung zerstört, immer viel weniger intensiv oder gar nicht nachweisbar.

Wenn in-vivo Zentrifugation wird eingesetzt, um eine bestimmte Organellen zu markieren, ist es hilfreich, Label, das Organellen mit einem fluoreszierenden Marker für die Bestätigung. Zum Beispiel, YFP-Fusionsproteine ​​gezielt an die Mitochondrien, die ER oder Golgi worden ⁴ beschrieben. In zentrifugiert Embryonen, reichern sich diese Marker an charakteristischen Stellen entlang der vorderen hinteren Achse (Abbildung 1). Schließlich lokalisieren bestimmten Histon-Fusionsproteine ​​sowohl Fetttröpfchen und Kerne ^2, und damit lassen sich diese zellulären Kompartimenten (Abbildung 5 E, F) sowie Mark auf die Bühne des Embryos überwacht werden (durch die Anzahl der markierten Kerne) . Fly-Stämme, die Markierungen in diesem Absatz genannten sind von der Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/) zur Verfügung. Für Histon H2Av sind beide GFP und mRFP Varianten ^{5, 6}

Abbildung 1. Trennung von Organellen durch Zentrifugation (modifiziert nach ^2). Zentrifugation von orientierten Embryonen Ergebnisse in unterschiedlichen Schichtung(Tageslicht). Wichtige Organellen sammeln sich an charakteristischen Stellen entlang der anterior (up) - posterior (down)-Achse: Fetttröpfchen (erkannt in festen Embryonen von Nile Red-Färbung); endoplasmatischen Retikulum, Golgi und Mitochondrien (erkannt in lebenden Embryonen über die YFP Marker beschrieben in Haupttext); Eigelb (nachgewiesen durch Autofluoreszenz). Die Fluoreszenz-Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie erworben.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des Embryos.

A. Ei mit Eierschale und den prominenten Ei Filamente (Rückenanhänge). Wie die Eierschale ist nicht transparent, erscheint das Ei gleichmäßig dunkel.

B. Ei mit Chorion entfernt. Am vorderen Ende (links), ist die Mikropyle sichtbar. Je nach Entwicklungsstadium, wird der Embryo innerhalb der Dotterhaut erscheinen einheitlich dunkelbraun oder zeigen verschiedene Strukturen. Siehe Abbildung 4 für Beispiele.

C zentrifugiert Embryo, orientiert wie im Protokoll beschrieben. Fetttröpfchen sammeln als braunes "cap" an der Mikropyle end; Eigelb bildet eine graue Schicht auf oder nahe dem entgegengesetzten Ende.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Verfahrens. Links: Embryonen ohne Chorion sind oben auf einer Agarplatte gelegt und schob mit einer Nadel in die Löcher in den Agar. Diese Montage ergibt sich eine konsequente Ausrichtung aller Embryonen, mit vorderen landet. Rechts: Nach Zentrifugation werden Embryonen geschichtet. Agar ist mit TSS (blau) überlagert, und Embryonen sind von der Agar mit der Nadel wieder. Einmal in TSS ausgesetzt, können Embryonen mit einer Pipette aufgenommen werden.

Abbildung 4. Bright-Licht Bilder von lebenden Drosophila-Embryos, ähnlich wie sie in Schritt 4.1 erscheinen. Die Embryonen werden in Standard-Orientierung dargestellt: vordere Ende auf der linken, hinteren Ende auf der rechten Seite, Rücken nach oben und Bauchseite nach unten. Ein Zeitraffer-Film der frühen Embryogenese ist als Teil des Videos zu dieser Protokoll.

A. Spaltung Embryonen erscheinen gleichmäßig braun. Stages wie diese sind ideal für In-vivo-Zentrifugation.

B. Blastoderm Embryonen haben eine klare Felge, die ähnlich wie auf allen Seiten angezeigt wird. Diese klare Peripherie ist in Teil aufgrund der Ansammlung von Kernen an der Plasmamembran und zum Teil aufgrund innerer Transport von Vesikeln und Eigelb Lipidtröpfchen ^7. Diese klare Peripherie erweitert, bis am Ende der Zellularisierung ^1. Embryonen können noch erfolgreich geschichtete durch Zentrifugation bis zum Ende des Zellularisierung ^8, obwohl Schichtung von Eigelb und Kerne nicht so konsequent wie in Furchungsstadien.

C. Nach Zellularisierung erscheinen Embryonen asymmetrischen; dorsalen und ventralen Seiten werden deutlich, und verschiedenen Falten entwickeln. Der Embryo gezeigt wird in der frühen Keim-Band-Erweiterung. In diesen Phasen ist die Zentrifugation nicht mehr an die Stratifizierung der wichtigsten Organellen wirksam.

Abbildung 5. Zentrifugierte Embryonen. Alle Embryonen in dieser Zahl waren mit ihrem vorderen Ende nach oben und zentrifugiert werden in dieser Ausrichtung gezeigt.

A. Bright-Licht Bild eines erfolgreichen zentrifugiert Embryo. Eine braune Schicht an der sehr vorderen Ende ist auf Lipid-Tröpfchen-Akkumulation. Eine breite, graue Schicht in der Nähe des hinteren Endes ist darauf zurückzuführen, Eigelb Vesikel. Es ist häufig eine klare Zone unterhalb der Dotter-Schicht, von unbekannter Herkunft. Eine gelbliche Zone ist oft höher als das Eigelb Schicht sichtbar, es stellt wahrscheinlich Mitochondrien. Lösliche Proteine ​​sind in der klaren Schicht zwischen Fetttröpfchen und Eigelb ² gefunden.

B. Der Embryo in A durch Epifluoreszenzmikroskopie unter UV-Anregung angesehen. Die blaue Autofluoreszenz charakteristischen Dotter hilft bei der Identifizierung des hinteren Endes.

C. Embryo zentrifugiert während Keim-Band-Erweiterung, dh nach Zellularisierung. Yolk möglicherweise noch am hinteren Ende ansammeln, aber ansonsten Schichtung ist minimal.

D. Erfolgreich geschichtete Embryo nach Hitzefixierung. Die Lipid-Tröpfchen-Schicht erscheint weiß und flauschig, anstatt dunkelbraun wie in unfixierten Embryonen (A).

E. & F. Embryonen zum Ausdruck His2Av-GFP und abgebildet durch konfokale Mikroskopie (modifiziert nach ^2). E: bei Furchungsstadien zentrifugiert; His2Av-GFP scheint erst der Lipid-Tröpfchen-Schicht, da nur wenige Kerne zu dieser Zeit gebildet werden. Abhängig von der Fokusebene kann Kerne werden direkt unter dem Tropfen Ebene sichtbar (hier nicht abgebildet). F: Bei Blastoderm Phasen zentrifugiert; His2Av-GFP ist sowohl der Lipid-Tröpfchen-Schicht (oben) und Kerne (in einer breiten Zone unterhalb des Tropfens Schicht).

Diskussion

Kritische Schritte

Stellen Sie sicher, dass der Agar-Konzentration hoch genug ist. Wenn es zu niedrig ist, wird der Agar während der Zentrifugation zerfallen, und die Embryonen platzen oder zufällig orientiert. Wenn der Agar-Konzentration ist nur etwas zu niedrig ist oder wenn der Agar ist nass (unzureichend getrocknet oder unzureichende Entfernung von überschüssigem TSS in Schritt 4,3), werden die Embryonen float aus ihren Löchern während des Laufs und werden falsch ausgerichtet. Wenn der Agar zu dünn gegossen ist, wird es auch zusammenbrechen oder Crack während der Zentrifugation.

Stellen Sie sicher, dass Embryonen nicht über Zellularisierung Stadien fortgeschritten. Anderenfalls wird die Trennung von Organellen nicht funktioniert (Abb. 5C) seit Organellen wird sequestriert in Tausenden von einzelnen Zellen. In jüngeren Embryonen auf der einen Zell-Stadium sind Organellen frei, um große Strecken wandern und reichern sich entsprechend ihrer charakteristischen Dichte. Um zu vermeiden, zu analysieren Embryonen, die zu alt sind, stellen Sie sicher, (i) eine Pre-Collection, damit Frauen, alte Eier (Schritt 2,4), (ii) zu sammeln Embryonen für 3 Stunden oder weniger (Schritt 2,5), (iii) lagen visuell auswählen Embryonen vor Zellularisierung Stadien für die Einbettung in Agar (Schritt 4,2), (iv) halten die Einbettung der Zeit kurz ist, um die Entwicklung bis zum Ende des Zellularisierung (Schritt 4,6) zu verhindern, und (v) zu verwerfen Embryonen, die nicht korrekt Schicht (Schritt 5,6) .

Sie sparen nicht auf die Zentrifugationszeit. Obwohl einige der Embryonen schöne Schichtung auch nach nur 10 Minuten Zentrifugation zeigen, ist die Trennung inkonsistent vom Embryo zum Embryo. 30 min dreht geben sehr konsistente Ergebnisse. Auch, desto länger die Zentrifugation Zeit, je länger die Schichten stabil sind nach der Zentrifugation wurde beendet. Dies ist für diejenigen Anwendungen, bei denen es braucht Zeit, um die Embryonen weiter verarbeiten vor Gebrauch wichtig (z. B., wenn sie für die Transplantation Versuche verarbeitet werden oder angebracht zum konfokalen Analyse benötigen).

Mögliche Änderungen

Eiersammlung und Chorion Entfernung Viele verschiedene Protokolle gibt es für die Schritte 2 und ^{3 1, 3, 9,} und wird ebenso wie Arbeiten der hier beschriebenen, solange die Embryonen verwendet jung sind, ist Ei Ausbeute hoch, und der Anteil der mis- inszeniert Embryonen wird minimiert.

Anterior-posteriore Ausrichtung Das Protokoll orientiert alle Embryonen, so dass das hintere Ende in der Agar ist begraben und am vorderen Ende ist (Abb. 3). Diese Orientierung ist gut für die Konsistenz, so dass es möglich ist, die Mikropyle als Landmarke, die am Ende während der Zentrifugation (Abb. 1, 5) wies verwenden. Doch mit der Praxis ist es einfach, wählen Sie die Ausrichtung des zentrifugiert Embryonen durch die unterschiedliche Aussehen der Lipid-Tröpfchen und Eigelb Schichten von Hellfeld-Mikroskopie. Dann wird es möglich, Embryonen mit einem Ende auffahren; diese Flexibilität beschleunigt die Montage-Prozess.

Unorientierten Zentrifugation Die-zeitaufwendig und technisch anspruchsvollen Aspekt des Protokolls ist die Montage des Embryos in Agar (Schritt 4). Es erfordert berühren Embryo zweimal (einmal, um sie in das Loch und einmal, um es nach der Zentrifugation zu erholen). Als Alternative kann man Embryonen im Schritt 4.1 Transfer in Reaktionsgefäßen mit TSS gefüllt. Wenn diese Rohre in einer Mikrozentrifuge (13.000 rpm, 10-30 min) werden zentrifugiert, Embryonen wird in der Regel auch Schicht gut ^10-13. Diese Variante ermöglicht es, Hunderte von Embryonen zur gleichen Zeit sehr schnell zu verarbeiten. Allerdings ist Schichtung nicht so konsequent, nur einen Bruchteil der Embryonen nicht entwickeln unterschiedliche Schichten trotz wesentlich höheren Zentrifugalkräften (~ 16.000 g) als in dem Protokoll über aufgetragen. Anspruchsvoller ist die Tatsache, dass die Ausrichtung der Embryonen Variable ist, und man kann die Trennung in verschiedenen Winkeln zu den großen Embryo Achse zu beobachten. Diese Variabilität erfordert die Versuchsleiter zu klären, nach der Zentrifugation, wie ein bestimmter Embryo im Zentrifugenglas wurde angeordnet. Mit dem Einsatz des Dotters Autofluoreszenz als Marker für die-dichte Teil des Embryos, ist dies oft möglich, obwohl es viel Übung und mehr Urteil, um es sicher zu tun erfordert. Wenn es genügend Embryonen in der Probe vorhanden sind, kann man in der Lage sein zu klären, die Fälle, in denen Embryonen geschehen, wie in Abb. arrangiert werden. 1.

Zentrifugation von Embryonen in ihren Eierschalen Es ist möglich, Embryonen in Agar für Schritt 4 einzubetten, ohne den Chorion ersten ^2. In diesem Ansatz werden Embryonen für die Sammlung Platte mit Halocarbonöl anstelle von 50% Bleichmittel in Schritt 3,2 (Halogenkohlenwasserstoff wird das Chorion transluzent) abgedeckt. Embryonen von geeigneten Stufen gewählt werden und auf eine neue Agarplatte mit einer Pinzette, durch Greifen nur das Ei Filamente mit der Pinzette, Schäden ander Embryo richtige ist vermieden. Die Embryonen werden wie in Schritt 4.4 durch 4,8 eingebettet, mit der vorderen Ei Filamente ragte aus dem Loch in der Agar. Die Eierschale ist um 50% Bleichmittel Behandlung entfernt werden, nachdem die Embryonen zentrifugiert wurde und aus dem Agar als in Schritt 5.4 gegraben. Zentrifugation in der Gegenwart der Eischale kann zur Verbesserung der Rate von devitellinization nach der Fixierung (Schritt 6.2), aber die Auswahl der richtigen Stadien für die Zentrifugation (Schritt 4.2) ist eine größere Herausforderung.

Anwendungen

Embryo Zentrifugieren ist besonders nützlich für Kolokalisation Experimente, dh zu testen, ob ein bestimmtes Protein lokalisiert zu einem gewissen wichtigen Organellen. Zum Beispiel der Klar-Proteins an der frühen Embryonalentwicklung Lipidtröpfchen wird, ist noch dieser Lokalisation eine Herausforderung, in intakten Embryonen zu demonstrieren. Zum Teil ist dies, weil sowohl Klar puncta und Fetttröpfchen in den Embryo Peripherie ¹⁰ sind reichlich vorhanden, so dass störende Kolokalisation schwer auszuschließen. Allerdings konzentriert sich Zentrifugation Fetttröpfchen in eine deutliche Schicht, und somit wird Kolokalisation mit Klar-Signal auf der Hand ^10.

Ähnliche Analyse hat eindeutig die Lokalisierung von anderen Proteinen zu Lipidtröpfchen ^{8, 13-15,} darunter überraschende Beispiele wie bestimmte Histone ² und in Fällen, in denen ein Protein vorhanden ist ubiquitär nachgewiesen, sondern bereichert auf Lipidtröpfchen ^8. Als Embryonen können optisch durch Entwicklungsstadium (Schritt 4,2) gewählt werden, ist es sogar möglich, entwicklungsregulierten Rekrutierung von Proteinen an Lipidtröpfchen ^{8, 15} zu erkennen. Testing für Kolokalisation mit Fetttröpfchen ist besonders einfach, da die Fetttröpfchen in eine optisch deutliche "cap" akkumulieren, so dass keine weiteren Marker oder Flecken ist erforderlich, um diese Schicht zu identifizieren. In der Tat, wegen seiner Leichtigkeit und potenziell auffälligen optischen Ergebnisse (Abb. 1, Abb.. 5 D, E), beschäftigt unser Labor diese Technik nun routinemäßig als ein erster Test, ob ein Kandidat Protein Lipidtröpfchen lokalisiert ist. Im Prinzip sollte ähnlich Kolokalisation Studien für die anderen Organellen in Abb. arbeiten. 1, und wahrscheinlich für andere (einschließlich intrazelluläre Parasiten), deren Verteilung in zentrifugiert Embryonen ist noch nicht dokumentiert werden.

Da Zentrifugation konzentriert Organellen in engen Bändern, erleichtert es Isolierung einer Fraktion in dieser Organellen angereichert. Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um die Fetttröpfchen zur Transplantation in Spender Embryonen ^{2. Datenwiederherstellung.} Es kann auch möglich sein, biochemisch analysieren die angereicherte Fraktion (zB durch Abschneiden Schichten aus Embryonen nach der Fixierung ^15).

Die hier beschriebene Methode hat Anwendungen jenseits Drosophila-Embryonen, wie Zentrifugation kann verwendet werden, um die Eier der vielen verschiedenen Arten (einschließlich Frösche, Nematoden, Manteltiere, Ringelwürmer, Seeigel, Muscheln und Nesseltiere) ¹⁶ schichten werden. In unserem eigenen Labor haben wir das Protokoll oben für Embryonen von der Stubenfliege Musca domestica ² verwendet und eingesetzt unorientierten Zentrifugation in der Analyse von Embryonen aus der Trauermücke Sciara coprophila ¹⁷ und die Schnecke Ilyanassa obsoleta ^17. Schließlich ist diese Methode nicht für Embryonen beschränkt: Die Zentrifugation kann auch sinnvoll sein, andere große Zellen, wie Oozyten (zB in Drosophila ^{2, 18} und die milkweed bug Oncopeltus fasciatus ¹⁷⁾ schichten. Für verschiedene Muster, müssen die genauen Zentrifugation Bedingungen optimiert werden: Zum Beispiel ist 10 Minuten bei 3000 g ausreichend ist, um effizient zu schichten Embryonen von Musca domestica ^2, und wenn zentrifugiert viel länger, neigen die Embryonen auseinander zu brechen während der Fixierung und Immunfärbung.

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773