اختبار نشاط Protozoacidal من يجند - lytic هضميدات ضد النمل الأبيض غوت البروتوزوا في المختبر (الثقافة البروتوزوا) و في الجسم الحي (Microinjection في المعى المؤخر النمل الأبيض)

Summary

نقدم إجراءات لإثبات أن يغاندس ربط غشاء سطح هذه هضم السليولوز الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية باستخدام المجهر الفلورسنت ويغاندس أن يقترن الببتيدات lytic تقتل البروتوزوا في المختبر (البروتوزوا اللاهوائية الثقافة) و في الجسم الحي (الحقن في المعى المؤخر النمل الأبيض).

Abstract

نحن نعمل على تطوير مقاربة جديدة لمكافحة النمل الأبيض الجوفية التي من شأنها أن تؤدي إلى تقليل الاعتماد على استخدام المبيدات الكيماوية. النمل الأبيض الجوفية التي تعتمد على الأوليات في hindguts العمال في هضم الخشب بكفاءة. وقد تبين أن الببتيدات Lytic لقتل مجموعة متنوعة من الطفيليات (Mutwiri آخرون 2000) والبروتوزوا أيضا في أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية ، Coptotermes formosanus (Husseneder وكولير 2009). الببتيدات Lytic هي جزء من الجهاز المناعي اللانوعي من حقيقيات النوى ، وتدمير الأغشية من الكائنات الحية الدقيقة (Leuschner وهانسيل 2004). الببتيدات معظم lytic ليس من المرجح أن يضر ارتفاع حقيقيات النوى ، لأنها لا تؤثر على حيادية كهربائيا أغشية الخلايا التي تحتوي على الكوليسترول العالي حقيقيات النوى (Javadpour وآخرون 1996). ويمكن توجيه عمل Lytic الببتيد لأنواع معينة من الخلايا من خلال إضافة ليجند. على سبيل المثال ، أفادت هانسيل وآخرون (2007) التي يمكن استخدامها الببتيدات lytic مترافق مع يغاندس سرطان الخلايا مستقبلات الغشاء لتدمير خلايا سرطان الثدي ، في حين أن الببتيدات lytic وحدها أو مترافق مع الببتيدات غير محددة لم تكن فعالة. الببتيدات Lytic كما تم مترافق للهرمونات البشرية التي تربط لمستقبلات على خلايا الورم لتدمير تستهدف خلايا البروستات وسرطان الخصية (Leuschner وهانسيل 2004).

في هذا المقال نقدم التقنيات المستخدمة للتدليل على وجود نشاط protozoacidal الببتيد lytic (هيكات) إضافة إلى يجند ببتيد سباعي الذي يربط لغشاء سطح البروتوزوا من أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية. هذه التقنيات تشمل استئصال الأمعاء من العمال النمل الأبيض ، والثقافة اللاهوائي للأمعاء البروتوزوا (Pseudotrichonympha grassii ، Holomastigotoides hartmanni ،
Spirotrichonympha leidyi) ، وتأكيد أن يجند المجهرية التي تحمل صبغة الفلورسنت بربط الأمعاء النمل الأبيض وغيرها من الأوليات حرة المعيشة البروتوزوا ولكن ليس للبكتيريا أو أنسجة الأمعاء. نظهر أيضا أن يجند نفسه بالإضافة إلى الببتيد lytic يقتل بكفاءة الأمعاء البروتوزوا النمل الأبيض في المختبر (الثقافة البروتوزوا) والحية (microinjection في المعى المؤخر العمال) ، ولكن أقل من الببتيد bacteriacidal lytic وحدها. خسارة يؤدي إلى موت الكائنات ذات الخلية الواحدة من النمل الأبيض في أقل من أسبوعين.

في المستقبل ، فإننا سوف مهندس وراثيا الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن يعيش النمل الأبيض في المعى المؤخر وينتشر عن طريق مستعمرة النمل الأبيض بأنه "حصان طروادة" للتعبير عن يجند - lytic الببتيدات التي من شأنها أن تقتل الطفيليات في الأمعاء النمل الأبيض ، وقتل لاحقا في مستعمرة النمل الأبيض . يجند - lytic الببتيدات يمكن أيضا أن تكون مفيدة لتطوير العقاقير لمكافحة الطفيليات.

Protocol

التجربة 1 : استخراج أمعاء النمل الأبيض تحت الظروف اللاهوائية البروتوزوا

1. استخدام مربع المروحة (مختبرات كوي) في علبة القفازات أن يعمم باستمرار من خلال الهواء المجففة ونوع D - Stak باكس حافزا للسيطرة على مستويات الرطوبة والأكسجين ، ودرجات حرارة متفاوتة القضاء. ملء علبة القفازات مع دفق مستمر من النيتروجين لمدة 20 الى 30 دقيقة. رصد مستويات الأوكسجين مع جهاز استشعار الأوكسجين (C - التربيعية ، وشركة) لمدة 1 ساعة. استخدام النيتروجين للوصول والحفاظ على الظروف اللاهوائية عند الحاجة.
2. إعداد Trager يو وسائل الاعلام (Trager 1934) وتعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0. Sparge وسائل الإعلام تصفية تعقيمها في علبة القفازات مع خليط من الهيدروجين بنسبة 2.5 ٪ و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون والنيتروجين 92.5 ٪ لمدة 1 ساعة إلى إزالة بقايا الأكسجين.
3. Silanize جميع المواد بما في ذلك شرائح المجهر ، وأنابيب microcentrifuge ، الماصات ، والأواني الزجاجية الخ المستخدمة في التجارب باستخدام Sigmacote لمنع امتصاص البروتوزوا الببتيدات أو على الأسطح (Sigmacote ، سيغما ، # SL - 2 ، http://www.sigmaaldrich.com/ الخ / medialib / مستندات / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. يجب أن أمعاء النمل الأبيض منذ البروتوزوا هي الكائنات اللاهوائية بدقة لا تكون عرضة للأوكسجين. لذا يتم تنفيذ الخطوات التالية في ظل الظروف اللاهوائية في علبة القفازات (انظر 1.1). مع ملقط يغرق الجسم كله عامل النمل الأبيض في الايثانول 70 ٪ ودوامة بلطف لنحو 10 ثانية لإزالة الملوثات السطحية.
5. إزالة عامل من الايثانول والسماح لتجف على Kimwipe نظيفة لنحو 20 ثانية. استخدام معقم غرامة يميل ملقط لعقد البطن عامل والاستيلاء على غيض من البطن مع زوج آخر من الملقط لسحب بلطف الأمعاء صعودا أو هبوطا في زاوية 45 درجة. إذا تم سحب الأمعاء في زاوية مستقيمة ومع الكثير من القوة فمن المحتمل أن يتفكك. 10 مكان الشجاعة في قطرة من وسائل الاعلام ميكرولتر 100 U Trager على شريحة المجهر.
6. بيرس الشجاعة مع زوج من تحقيقات عقيمة تشريح غرامة للافراج عن البروتوزوا ونقل محتويات القناة الهضمية بلطف مع 200 ميكرولتر ماصة في أنبوب microcentrifuge 1 مل يحتوي على 900 ميكرولتر Trager يو وسائل الاعلام. بعد السماح للترسيب من الشظايا جدار القناة الهضمية (5 ق) ، ونقل 900 ميكرولتر من طاف لأنبوب جديد.
7. نقل 10 ميكرولتر الثقافة البروتوزوا إلى شريحة المجهر sigmacoted والتحقق من حالة البروتوزوا تحت المجهر في التكبير X 200.
8. تعد السيطرة على الثقافات الكمثرية الهوائية رباعية البروتوزوا ، الأميبة س. ، الحنديرة س. والمتناعلة س. (كارولينا شركة التموين البيولوجي ، برلنغتون ، NC) فضلا عن الثقافة بين عشية وضحاها من القولونية في وسائل الاعلام الثقافة الذي أوصت به المورد.

التجربة 2 : يجند إضافة إلى جانب وجود صبغة الفلورسنت لالبروتوزوا والبكتيريا الثقافات لاختبار ملزمة لأغشية الخلايا السطحية والجدران

كنا سابقا المكتبات عرض بالعاثية (نيو إنجلاند Biolabs المؤتمر الوطني العراقي ، ايبسويتش ، MA) لتحديد تسلسل 19 ببتيد سباعي التي تربط لالبروتوزوا (البروتوكولات المتاحة في http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). تم تصنيعه ليجند مع سلسلة ببتيد (ALNLTLH) التي أظهرت أن التشابه جليكوبروتينات المفترضة المعروفة من الغشاء المثقبية البروسية وبالإضافة إلى التحقيق الفلورسنت C - الطرفي (EDANS ، 5 -- ((2 Aminoethyl) الأمينية) النفثالين - 1 - السلفونيك حامض ، λmax = 341 نانومتر ، 471 نانومتر = λem) عبر الصلبة الببتيد التوليف (SSPS) باستخدام راتنج NovaTag EDANS (EMD العلوم البيولوجية). هنا علينا أن نظهر أن يجند بربط البروتوزوا التي كانت معزولة من الأمعاء النمل الأبيض وغيرها من الدول الحرة التي تعيش البروتوزوا ، ولكن ليس للبكتيريا.

1. وحيد الخلية الثقافة كما هو موضح في التصدير. 1. الإصلاح البروتوزوا مع الفورمالديهايد بنسبة 10 ٪ في 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة.
2. الطرد المركزي الحل البروتوزوا (30 XG ، 10 دقيقة) ، تجاهل طاف ويغسل بيليه الذي يحتوي على البروتوزوا الثابتة مرتين في وسائل الاعلام Trager 1ml يو. إعادة تعليق بيليه في 1 مل الإعلام Trager يو. أيضا ، وغيرها من البروتوزوا الإصلاح ، وهاء. البكتيريا القولونية عن الضوابط.
3. احتضان الكائنات الدقيقة ثابت لمدة 1-2 ساعة مع حل يجند توليفها بالإضافة إلى EDANS صبغة الفلورسنت (المعد في الماء) بتركيز نهائي من 50 ميكرومتر. ويجند يذوب في الماء أفضل من Trager U سائل الإعلام.
4. مراقبة الكائنات الدقيقة تحت المجهر الفلورسنت في التكبير X 400 في حد أقصى إلى 341 نانومتر الامتصاصية وانبعاث في منطقة الزرقاء في 471 نانومتر.

التجربة 3 : اختبار النشاط protozoacidal من جانب ليجند الببتيد lytic في المختبر (الثقافة البروتوزوا)

تم تصنيعه من قبل ألف المتقارن ليجند وlytic الببتيد هيكات (Mutwiri وآخرون 2000) في مرفق البروتين LSU.

1. Silanize المواد وإعداد ثقافة أمعاء النمل الأبيض البروتوزوا في علبة القفازات اللاهوائية فترةووصف ليالي في التصدير. 1.
2. إعداد الثقافات من الكائنات الحية الدقيقة السيطرة الميكروب الهوائي (على سبيل المثال ، كولاي والأنواع التي تعيش بحرية البروتوزوا الكمثرية T.).
3. في البيئة اللاهوائية لعلبة القفازات ، ماصة 6 aliquots من 198 ميكرولتر من ثقافة البروتوزوا إلى 0.5 مل أنابيب إيبندورف. إضافة 2 ميكرولتر من حل ميكرومتر 100 من يجند - lytic الببتيد إلى نصف aliquots (النهاية تركيز 1 ميكرومتر) للثقافة أمعاء النمل الأبيض البروتوزوا. إضافة 2 ميكرولتر من المياه إلى النصف الآخر من aliquots (الضوابط).
4. على الفوق ، وإعداد aliquots مماثلة من E. القولونية وT. الكمثرية مع 1 ميكرومتر الببتيد الببتيد lytic يجند - lytic ، أو الماء.
5. بعد 1 ساعة ، ونقل 10 ميكرولتر من كل ثقافة البروتوزوا على الشرائح. قارن بقاء تعامل البروتوزوا إلى أن الضوابط تحت المجهر في التكبير X 200.
6. بعد 1 ساعة ، لوحة 100 ميكرولتر تقريبا. 10 ^-4 التخفيف من E. القولونية على الثقافات واحتضان بهي عند 37 درجة مئوية خلال الليل. مقارنة أعداد الوحدات مستعمرة تتشكل على لوحات.

التجربة 4 : حقن من جانب ليجند صبغة الفلورسنت في النمل الأبيض في المعى المؤخر

1. سحب الإبر (النموذجي GD - 1 ، 1 X 900 مم) باستخدام مجتذب Narishige micropipette PC - 10 الزجاج مع مستوى المرحلة الحرارة المزدوجة (65 و 48) للحصول على حجم غيض من 20-30 ميكرون. تأكيد حجم غيض من خلال قياس تحت المجهر باستخدام ميكرومتر.
2. ملء أحد إبرة مع كاليفورنيا. أوقفت 30 من 50 ميكرومتر ميكرولتر من يجند ملحوظ fluorescently في الماء باستخدام محقنة المرفقة. ملء إبرة أخرى بالماء للسيطرة. إرفاق micropipette (0.5 ميكرولتر القدرات و 32 ملم طول ، دروموند الشركة العلمية) لحامل في micromanipulator. نعلق إبرة لحقن حامل النظام في micromanipulator الثانية. تعيين المعلمات حقن أولية لمدة ما يقرب من 1 نبض ق و 10-12 رطل الحقن. دفع إبرة ببطء في micropipette وحقن محلول باستخدام دواسة يحركها عالية السرعة نظام حقن إلكتروني مع نبض مراقبة طول تعلق على تدفق الغاز النيتروجين للرقابة ، مما يضمن أن يتم حقن بتكاثر وحدة تخزين ثابتة. بعد الحقن ، وإزالة micropipette وسجل طول الحل باستخدام حقن الورنية الفرجار. حساب حجم حقن من المعلمات من المعروف micropipette. ضبط ضغط غاز النيتروجين وطول نبضة لطرد 0.3 ميكرولتر حل في حقنة واحدة.
3. ضغط نهاية البطن عامل النمل الأبيض اللين مع ملقط لإزالة أي الحاضر الفضلات في المستقيم. شل عامل النمل الأبيض التي تقشعر لها الأبدان منهم على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. جعل استقبال العمال لعقد النمل الأبيض بقطع 100 نصائح ماصة ميكرولتر باستخدام شفرة المشرط. قطع رأس لمدة من 10 -- 12 ملم ، واستخدام وفقا لحجم النمل الأبيض.
5. نعلق المتلقي إلى micromanipulator. مكان عامل على طبق بيتري على الجانب الظهري ونضح رئيس العمال لأول مرة في الاستقبال باستخدام مضخة شفط النيتروجين بحيث محطة ليبرز عامل من المتلقي.
6. عقد النمل الأبيض في جهاز الاستقبال ، مقدما بعناية شغل الإبرة باستخدام micromanipulator لإدراجه في فتحة الشرج عامل. ضخ 0.3 ميكرولتر من الحل (يجند ملحوظ fluorescently أو الماء للضوابط).
7. مكان العمال حقنوا يجند أو الماء في أطباق بتري ورقة منفصلة مع تصفية الرطوبة والاحتفاظ بها في 26 ± 2 درجة مئوية مع نسبة 78 ٪ RH
8. استئصال الشجاعة من النمل الأبيض حقن وجمع البروتوزوا بعد 24 ساعة كما هو مبين أعلاه في التصدير. 1. الإصلاح ومراقبة الكائنات ذات الخلية الواحدة كما هو مبين في التصدير. 2.

التجربة 5 : اختبار النشاط protozoacidal من جانب ليجند الببتيد lytic في الجسم الحي (الحقن في المعى المؤخر النمل الأبيض)

1. Silanize المواد كما هو موضح في التصدير. 1.
2. يعد حل ميكرومتر 500 من الببتيد يجند - lytic في الماء.
3. اتبع الخطوات من 3.1) من خلال 3.4) لإعداد الإبر والزجاج وأجهزة الاستقبال وعمال النمل الأبيض.
4. وفقا للأساليب وصفها في 3.5) بضخ 0.3 ميكرولتر من محلول الببتيد يجند - lytic (العلاج) أو الماء (السيطرة) في المعى المؤخر العمال النمل 20.
5. عقد النمل الأبيض لمدة 24 ساعة ، والشجاعة من استئصال عدة عمال ومراقبة محتويات الأمعاء تحت المجهر كما هو موضح في 3.6). و 3.7).
6. في أقرب وقت أكدت وفاة الأوليات في أمعاء النمل الأبيض ، والحفاظ على ما تبقى النمل الأبيض المعالجة والتحكم في أطباق بتري مع فلتر ورقة رطبة ومراقبة وفيات يوميا.

ممثل النتائج :

التجربة 1 : عادة ما يتم الحصول على المعى الأمامي ، المعي المتوسط ​​والمعى المؤخر في قطعة واحدة عند اتباع الإجراء بشكل صحيح (الشكل 1A). وحيد الخلية الموجودة في كثافة عالية في أجزاء من المعى المؤخر اللاهوائية ، ويمكن أن يكون صدر عن اختراق المعى المؤخر مع ملقط (1B الشكل 1 و 2). أكبر بروتوالأنواع زوا في أمعاء النمل الأبيض والجوفية الفرموزية هو على شكل مغزلي P. grassii ، وهو 200-300 ميكرون واسعة وطويلة 150 ميكرون ، ويمكن رؤيته بالعين المجردة. هذه الأنواع هي ثاني أكبر حاء على شكل كمثرى hartmanni (50-140 ميكرومتر طولا و 30-80 ميكرون). أصغر الأنواع هي على شكل مخروط S. leidyi (15-50 ميكرومتر طولا و 8-30 ميكرون ؛ لاي وآخرون 1983). يتم عرض أنواع البروتوزوا في الشكل 2.

في ظل ظروف مثلى الثقافة والأنواع الثلاثة من البروتوزوا معزولة من أمعاء النمل الأبيض الجوفية الفرموزية البقاء على قيد الحياة وسليمة لما لا يقل عن 72 ساعة في وسائل الاعلام U Trager اللاهوائي (الشكل 3A). ومع ذلك ، إذا كانت الظروف الثقافة ليست هي الأمثل والبروتوزوا يموت بسرعة. إذا كان هناك بقايا للأكسجين في وسائل الإعلام ، فإن حركة البروتوزوا تتوقف فورا. واذا ضغط التناضحي عالية جدا أو الغشاء للخطر سلامة غشاء سطح انتفاخ والبروتوزوا الخروج وتمزق الخلايا (الشكل 3B). إذا كان الضغط الاسموزي منخفض جدا أو المساس الأغشية ، وسوف تذبل والبروتوزوا يتقلص (الشكل 3C).

التجربة 2 : نحن أكد أن يجند بالإضافة إلى التحقيق الفلورسنت ملزمة لجميع الأنواع الثلاثة من البروتوزوا من المعى المؤخر من النمل الأبيض الجوفية في كثافة الفرموزية كشفها. ملزم يجند يحدث على سطح الخلية بأكملها (الشكل 4). وتتركز مواقع الربط في المنطقة الأمامية من الأوليات على الإبرة المحورية (ورقة من ميكروتثبول) ونواة في P. grassii.

لاحظنا بعض تألق ذاتي غير مكتمل من جزيئات الخشب ابتلاعها من قبل البروتوزوا. ومع ذلك ، تألق ذاتي هو عادة من السهل أن نستشف ملزمة محددة من يجند ، اذ لا يوجد اي تألق ذاتي من السطح ، والإبرة المحورية النواة (الشكل 4).

نحن أيضا الكشف عن مضان في جميع الأنواع اختبار الهوائية التي تعيش بحرية البروتوزوا (الشكل 5) ، مما يوحي بأن يجند بربط الهياكل العامة لالبروتوزوا. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي ملزمة ليجند E. القولونية.

قتل واحد من ميكرومتر يجند - lytic الببتيد جميع الأنواع الثلاثة من البروتوزوا من الأمعاء العمال الفرموزية النمل الأبيض الجوفية وT. الحرة الحية : تجربة 3 الكمثرية في المختبر في أقل من 10 دقيقة ، في حين بقيت تسيطر على قيد الحياة. الشكل 6 يبين الفقدان التدريجي للسلامة غشاء الأمعاء النمل الأبيض البروتوزوا تعامل مع يجند - lytic الببتيد. انتفاخ وتمزق الأغشية ، البروتوزوا تذبل وتموت. لم يلاحظ أي فرق في عدد من E. المستعمرات القولونية بين المعالجات من يجند - lytic الببتيد والمياه. الببتيد Lytic مع عدم وجود يجند ، ومع ذلك ، انخفض عدد E. المستعمرات القولونية كبير (الشكل 7). هذا يشير إلى أن تعلق يجند لبعض الكائنات الحية الدقيقة تحمي درجة غير المستهدفة من تحلل.

التجربة 4 : عندما تم حقن 50 ميكرولتر 0.3 ميكرومتر ليجند fluorescently ملحوظ في المعى المؤخر العمال النمل الأبيض ، وملزمة لP. grassii ، S. leidyi وحاء وأكد hartmanni عبر المجهر مضان مشابهة التصدير. 2 (الشكل 4). لم أنسجة الأمعاء النمل الأبيض لا تظهر مضان.

قتل حقن 0.3 ميكرومتر 500 ميكرولتر يجند - lytic الببتيد جميع الأنواع الثلاثة من الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الجوفية داخل الفرموزية 24H : تجربة 5. توفي النمل الأبيض في غضون 10 أيام بعد خسارة البروتوزوا بهم تكافلية. في السابق ، وحقن Husseneder كولير (2009) نفس التركيز من الببتيد lytic في أحشاء النمل الأبيض. دون أن يجند المرفقة ، استغرق الأمر وقتا أطول حتى البروتوزوا في القناة الهضمية (72 ساعة) ، والنمل الأبيض قد لقوا حتفهم (ستة أسابيع). هذا يشير إلى أن يجند زيادة الكفاءة protozoacidal من الببتيدات lytic ، وعلى الأرجح عن طريق ربط الببتيدات lytic لالبروتوزوا.

الشكل 1. أ : أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية على شريحة عرض المقاطع الرئيسية للأمعاء (الصدارة ، منتصف المعى المؤخر) ؛ ب 1 & 2 : مثقوب المعى المؤخر مع ملقط للافراج عن محتوى الأمعاء تحتوي على الطفيليات.

الشكل 2. الأنواع الثلاثة من سوطي البروتوزوا وجدت في المعى المؤخر من النمل الأبيض والجوفية الفرموزية : أ) Pseudotrichonympha grassii ، ب) Holomastigotoides hartmanni ، ج) leidyi Spirotrichonympha.

الشكل 3. البروتوزوا في الثقافة ، والصحية) البروتوزوا ،) البروتوزوا مع انتفاخ الأغشية ب ، ج) ذبل البروتوزوا.

الشكل 4. تأكيد الملزمة للجانب يجند لتحقيق أمعاء النمل الأبيض لالفلورسنتالبروتوزوا (من أعلى إلى أسفل : P. grassii ، H. hartmanni ، S. leydi) ، وتعامل مع يجند ملحوظ fluorescently وضوابط غير المعالجة (إظهار تألق ذاتي).

الشكل 5. يجند ملزم لتحرير المعيشة البروتوزوا الهوائية ، أ) رباعية ، ب) الأميبة ، ج) الحنديرة ، والمتناعلة د).

الشكل 6. علاج الطفيليات مع الماء) (السيطرة) و (ب)) 1 ميكرومتر يجند - lytic الببتيد.

الشكل 7. E. المستعمرات القولونية على لوحات (10 تمييع ^-4) : أ) المعالجة بمياه (السيطرة) ، ب) المعالجة مع 1 ميكرومتر يجند - lytic الببتيد ، ج) المعالجة مع 1 ميكرومتر الببتيد lytic.

Discussion

وقد يجند - lytic الببتيدات استخدمت بنجاح لهدف على نحو فعال وتدمير الخلايا السرطانية (هانسيل وLeuschner 2004 ، هانسيل وآخرون 2007). بناء على هذا المفهوم ، قمنا بتطوير يجند ببتيد سباعي التي تربط إلى سطح الأوليات في أمعاء النمل الأبيض الفرموزية الجوفية وبالإضافة إلى الببتيد lyt...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Anaerobic glove box	Coy Laboratories, Inc.	Custom made
Intellus environmental controller	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 Glass micropipette puller	Narishige International	PC-10
Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Leitz micromanipulators	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Microinjector	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA fluorescence imaging system	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA dissecting scope	Leica Microsystems	MZ16
LEICA microscope	Leica Microsystems	DMLB
Olympus dissecting scope	Olympus Corporation	SZ61