Protozoa Termit Gut Karşı Ligandla litik Peptitler Protozoacidal Aktivitesi Test In vitro (Protozoa Kültür) ve In vivo (Mikroenjeksiyon içine Termit Hindgut)

Özet

Ligandlar protozoa Formosan litik peptitler ile birleştiğinde floresan mikroskopi ve bu ligandlar kullanılarak yeraltı termitler bağırsak protozoa öldürmek selüloz sindiren bu yüzey membran bağlamak gösteren prosedürleri mevcut In vitro (Anaerobik protozoa kültürü) ve In vivo (Termit hindgut içine enjeksiyon).

Özet

Biz kimyasal pestisit kullanımı konusunda daha az güven yol açacak yeraltı termit kontrol etmek için yeni bir yaklaşım geliştirmektedir. Yeraltı termitler, ahşap sindirmek için verimli işçi hindguts protozoa bağlıdır. Parçalayıcı peptidler, protozoa parazitleri (Mutwiri ve ark 2000) çeşitli öldürmek için gösterilen ve aynı zamanda Formosan yeraltı termit, Coptotermes formosanus (Husseneder ve Collier 2009) bağırsak protozoa olmuştur . Parçalayıcı peptidler ökaryotlar nonspesifik bağışıklık sisteminin bir parçasıdır ve mikroorganizmalar (Leuschner ve Hansel 2004) membranlar yok. En litik peptidler, onlar daha yüksek ökaryotlar (Javadpour ve ark 1996), elektriksel olarak nötr kolesterol içeren hücre zarlarının etkilemez çünkü daha yüksek ökaryotlar zarar vermek olası değildir. Parçalayıcı peptid eylem ek bir ligand tarafından belirli bir hücre tipleri için hedef olabilir. Örneğin, Hansel ve ark (2007), tek başına veya non-spesifik peptitler ile konjuge litik peptidler etkili olurken, kanser hücre zarı reseptörü ligandlar ile konjuge litik peptidler, meme kanseri hücrelerini yok etmek için kullanılan olabilir olduğunu bildirdi. Parçalayıcı peptidler de, prostat ve testis kanseri hücreleri (Leuschner ve Hansel 2004) hedeflenen yıkımı için tümör hücrelerinin reseptörlerine bağlanır hormonları konjuge edilmiştir.

Bu yazıda, bağırsak Formosan yeraltı termit protozoa yüzey membran bağlanır heptapeptide ligand birleştiğinde bir litik peptid (Hekate) protozoacidal faaliyet göstermek için kullanılan teknikler mevcut. Bu teknikler ekstirpasyonu termit işçilerden gut, gut anaerobik kültür (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, protozoa
Spirotrichonympha leidyi), mikroskobik onay ligand floresan boya ile işaretlenmiş, tek hücreli canlılar ve değil, bakteri ya da bağırsak dokusu protozoa serbest yaşayan diğer termit gut bağlanır. Ayrıca parçalayıcı bir peptide aynı ligand verimli,, in vitro (protozoa kültürü) ve in vivo (işçi hindgut içine mikroenjeksiyon) protozoa termit gut öldürür, ama yalnız litik peptid daha az bacteriacidal olduğunu göstermektedir . , En az iki hafta içinde termitler ölümü protozoa yol açar kaybı.

Gelecekte, termit gut protozoa öldürmek ve daha sonra koloninin termitler öldürecekti ligand litik peptidler ifade etmek için "Truva Atları" gibi bir termit kolonisi ile termit hindgut ve yayılması hayatta mikroorganizmaların genetik mühendisi olacak . Ligand-litik peptidler protozoa parazitlere karşı ilaç geliştirme için de yararlı olabilir.

Protokol

Deney 1: termit gut çıkarımı anaerobik koşullar altında protozoa

1. Nem ve oksijen seviyelerini sürekli olarak kontrol ve ısı eşitsizliği ortadan kaldırmak için bir kurutucu ve D tipi katalizör Stak Paks ile hava dolaşımı için bir torpido gözü bir fan kutusu (Coy Laboratories) kullanın. 20 ila 30 dakika azot sürekli bir akış ile torpido gözü doldurun. 1 saat için bir oksijen sensörü (C-squared, Inc.) Oksijen düzeyleri Monitör Azot gerektiğinde anaerobik şartlara ulaşmak ve korumak için kullanın.
2. Träger U ortam hazırlayın (Träger 1934) ve pH 7.0 'ye ayarlamak. % 2.5,% 5 hidrojen, karbon dioksit ve oksijen kalıntılardan temizlemek için 1 saat süreyle% 92.5 azot karışımı ile torpido gözü filtre steril medya Sparge.
3. Adsorpsiyon önlemek için Sigmacote kullanarak deneylerde kullanılan mikroskop lamı, mikrosantrifüj tüpler, pipetler, cam vb dahil olmak üzere tüm malzemeler Silanize protozoa ya da yüzeylere peptidler (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / medialib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Protozoa termit gut kesinlikle anaerobik organizmalar oldukları için, oksijene maruz bırakılmamalıdır. Bu nedenle aşağıdaki adımları bir torpido gözü (1.1) anaerobik koşullar altında yapılmaktadır. Forseps batığın bir termit işçinin% 70 etanol ve yaklaşık 10 sn boyunca hafifçe girdap yüzey kirleri çıkarmak için bütün vücudu.
5. Etanol işçi çıkarın ve yaklaşık 20 saniye süreyle temiz Kimwipe kurumasını bekleyin Işçi karın tutun ve yavaşça yukarıya veya aşağıya doğru 45 derecelik bir açı gut çekmek için başka bir çift forseps ile karın ucu kapmak için ince uçlu steril bir forseps kullanın. Bağırsak düz bir açıyla ve çok fazla bir güçle çekilir parçalayın muhtemeldir. (10) bir mikroskop lamı üzerine 100 ul Träger U medya bir damla cesaret yerleştirin.
6. Pierce, serbest bırakmak için steril ince diseksiyon probları bir çift ile bağırsaklar protozoa ve 200 ul pipet yardımıyla 1 ml mikrosantrifüj 900 ul Träger U medya içeren bir tüp içine yavaşça bağırsak içeriğini aktarmak. Bağırsak duvar parçaları (5 sn), yeni bir tüp süpernatant transferi 900 ul sedimantasyon için izin.
7. 10 ul protozoa kültürü sigmacoted bir mikroskop lamı aktarın ve 200 X büyütmede bir mikroskop altında protozoa durumunu kontrol edin.
8. Aerobik protozoa Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp, Euglena sp, ve Paramecium sp kontrol kültürleri hazırlayın. (Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi, Burlington, Kuzey Carolina) yanı sıra, tedarikçi tarafından önerilen kültür ortamı Escherichia coli bir gecede kültür olarak .

Deney 2: floresan boya ile birleştiğinde Ekle ligand protozoa ve bakteri kültürleri yüzey membranları ve hücre duvarlarının bağlanarak test etmek için

Biz daha önce faj ekran kütüphaneleri (New England Biolabs A.Ş., Ipswich, MA) (mevcut http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf protokolleri) protozoa bağlamak 19 heptapeptide dizileri tanımlamak için kullanılır. Trypanosoma brucei membran bilinen varsayılan glikoproteinler benzerlikler gösteren bir peptid dizisi (ALNLTLH) ligandı sentezlenmiş ve C-terminal floresan prob (EDANS, 5 akuple - ((2 aminoetil) amino) naftalin-1-sülfonik EDANS NovaTag reçine (EMD Biosciences) kullanarak katı hal peptid sentezi (SSPS) ile asit, λmax = 341 nm, λem = 471 nm). Burada termit protozoa, ancak serbest yaşayan bakteriler için değil bağırsak ve izole olduğunu protozoa ligand bağlar olduğunu göstermektedir.

1. Kültür Exp açıklandığı gibi protozoa. 1. 12 saat boyunca% 10 formaldehit, 4 ° C ile protozoa Fix
2. Protozoa çözüm Santrifüj (30 xg, 10 dk), süpernatantı atmak ve sabit iki kez 1ml Träger U medya protozoa içeren pelet yıkayın. Pelet 1 ml Träger U medyada yeniden askıya. Ayrıca, protozoa diğer düzeltmek, ve E. kontrolleri için coli bakterisinin.
3. 50 mcM son bir konsantrasyonda floresan boya EDANS (suda hazırlanmış) sentezlenen ligand çözümü ile 1-2 saat süreyle sabit mikroorganizmaların inkübe edin. Ligand Träger U medya suda daha iyi çözünür.
4. Absorbans 341 nm'de maksimum ve 471 nm dalga boyunda mavi bölgede bir emisyon 400 X büyütmede bir floresan mikroskop altında mikroorganizmaların uyun.

Deney 3: Test in vitro parçalayıcı bir peptid (protozoa kültürü) ligand protozoacidal faaliyet

LSU Protein Tesisleri'nde bir konjuge ligand ve parçalayıcı peptid Hekate (Mutwiri ve ark 2000), daha önce sentezlenmiştir.

1. Silanize malzemeleri ve anaerobik bir torpido gözü termit gut protozoa kültürü hazırlamakExp nitelendirdi. 1.
2. Aerobe kontrolü mikroorganizmalar (örneğin, E. coli ve serbest yaşayan protozoa türlerinin T. pyriformis) kültürleri hazırlayın.
3. Torpido gözü, 0.5 ml Eppendorf tüpleri içine protozoa kültürü 198 ul pipet 6 alikotları anaerobik ortamda. Termit gut protozoa kültürü alikotları yarısı (son konsantrasyonu 1 mcM) ligand litik peptid 100 mcM çözüm 2 ul ekleyin. Alikotları diğer yarısı (kontrol) 2 ul su ekleyin.
4. Benchtop, E. benzer alikotları hazırlamak coli ve T. 1 mcM litik peptid, ligand-litik peptid ya da su ile pyriformis.
5. 1 saat sonra, slaytlar 10 ul protozoa her kültür transferi. 200 X büyütmede bir mikroskop altında kontrol protozoa tedavi edilen hayatta kalma karşılaştırın.
6. 1 saat sonra, yaklaşık 100 ul plaka. E. 10 ^-4 dilüsyon ° C gecede 37 BHI ve inkübe coli kültürleri. Plakalar üzerinde koloni oluşturan birimlerin numaralarını karşılaştırın.

Deney 4: termit hindgut içine bir floresan boya birleştiğinde ligand Enjeksiyon

1. 20-30 mikron bir ucu boyutu elde etmek için bir çift kademeli ısı seviyesi (65 ve 48) ile bir Narishige PC-10 cam mikropipet çektirmenin kullanarak iğneler (Model GD-1, 1 X 900 mm) çekin. Mikrometre kullanılarak mikroskop altında ölçüm ucu boyutu onaylayın.
2. Ca bir iğne doldurun. Floresan işaretli ligand 50 mcM 30 ul bağlı bir şırınga yardımıyla su askıya aldı. Kontrolü için başka bir iğne su ile doldurun. Tutucu bir micromanipulator mikropipet (0.5 ul kapasitesi ve 32 mm uzunluğunda, Drummond Bilimsel Şirketi) takın. , Ikinci bir mikromanipülatör enjeksiyon sistemi tutucu bir iğne takın. Yaklaşık 1 s darbe uzunluğunda ve 10-12 psi enjeksiyon için ilk enjeksiyon parametrelerini ayarlayın. Mikropipet yavaş yavaş iğne Advance, sabit bir ses tekrarlanabilir enjekte olmasını sağlar kontrollü bir nitrojen gazı akışı, bir darbe uzunluğu kontrolü ile çözüm odaklı bir pedal yüksek hızlı elektronik enjeksiyon sistemi ile enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra, mikropipet çıkarın ve Vernier'dan kaliper kullanılarak enjekte çözüm uzunluğu kaydedin. Mikropipet bilinen parametreleri enjekte edilen hacim hesaplayın. Azot gazı basıncı ve nabız uzunluğu, tek bir enjeksiyon 0.3 ul çözüm sınırdışı ayarlayın.
3. Rektum herhangi bir dışkı hediye kaldırmak için, yumuşak forseps bir termit işçi karın sonuna sıkın. 5 dakika boyunca buz üzerinde tüyler ürpertici işçi termit hareketsiz.
4. Bir neşter bıçak kullanarak 100 ul pipet uçları keserek termit işçi tutmak için alıcıları olun. Cut ucu uzunluğu 10 - 12 mm ve termit büyüklüğüne göre kullanmak.
5. Mikromanipülatör alıcı takın. Petri kabı, sırt tarafında bir işçi yerleştirin ve bir azot emme pompası kullanarak Receiver'e ilk işçi baş aspire böylece alıcı işçi çıkıntı terminus.
6. Holding alıcı termit, işçi anüs içine eklemek için mikromanipülatör kullanarak dolu iğne dikkatli bir şekilde ilerlemek. Ul çözüm 0.3 (kontroller için floresan işaretli ligand veya su) enjekte edilir.
7. Nemli filtre kağıdı ile ayrı petri kaplarına ligand veya su enjekte işçilerin 26 koyun ve onları tutmak ± 2 ° C ile% 78 RH
8. Enjekte termitler cesaret toplamak ve kökünü kaziyacak Exp yukarıda gösterildiği gibi, 24 saat sonra protozoa. 1. Düzeltme ve gözlemlemek gibi Exp gösterilen protozoa. 2.

Deney 5: Test in vivo parçalayıcı bir peptid (termit hindgut içine enjeksiyon) ligand protozoacidal faaliyet

1. Uzm açıklandığı gibi malzemeler Silanize. 1.
2. Su ligand litik peptid 500 mcM çözüm hazırlayın.
3. Cam iğneler, alıcıları ve termit işçileri hazırlamak için adımları 3.1) 3.4) üzerinden izleyin.
4. 3.5 'te açıklanan yöntemleri) ligand-litik peptid çözümü (tedavi) veya su (kontrol) 0.3 ul 20 termit işçilerin hindgut içine enjekte ardından.
5. 24 saat için birkaç işçi termitler, kökünü kaziyacak cesaret tutun ve 3.6 'da açıklandığı gibi) mikroskop altında bağırsak içeriği gözlemlemek. ve 3.7).
6. Termit gut protozoa bir ölüm onaylandıktan kısa sürede, nemli filtre kağıdı ile Petri kutularına kalan tedavi termitler ve kontroller tutmak ve günlük mortalite gözlemlemek.

Temsilcisi Sonuçlar:

Deney 1: Genellikle, foregut, midgut ve hindgut prosedürü doğru bir şekilde takip etmektedir (Şekil 1a) tek parça olarak elde edilir. Hindgut anaerobik porsiyonlar halinde yüksek yoğunluklu yaşayan tek hücreli canlılar ve forseps (Şekil 1b 1 ve 2) hindgut piercing açığa çıkabilir. En büyük protoFormosan yeraltı termit bağırsak Zoa türler iğ şeklinde P. grassii, 200-300 mikron uzunluğunda ve 150 mm genişliğinde ve çıplak gözle görülebilir. Ikinci büyük türler armut biçimli H. hartmanni (50-140 mikron uzunluğunda ve 30-80 mikron geniş). Küçük türlerin koni şeklinde S. leidyi (15-50 mikron uzunluğunda ve 8-30 mikron genişliğinde, Lai ve ark, 1983) . Protozoa türleri Şekil 2'de gösterilmiştir.

Optimal kültür koşullar altında Formosan yeraltı termitler bağırsak izole protozoa üç tür anaerobik Träger U medya (Şekil 3a) en az 72 saat süreyle canlı ve sağlıklı kalacaktır. Ancak, kültür koşullarının uygun değilse protozoa hızlı ölecektir. Medya oksijen kalıntı varsa, protozoa hareketi hemen sona erecektir. Ozmotik basıncı çok yüksek protozoa olacak çıkıntı ve hücrelerin rüptürü (Şekil 3b) yüzey membran bütünlüğünü tehlikeye veya membran. Osmotik basıncı çok düşük veya tehlikeye membranlar ise, protozoa (Şekil 3c) büzüşmeli ve küçülecektir.

Deney 2: Biz ligand saptanabilir yoğunluklarda Formosan yeraltı termitler hindgut gelen protozoa üç tür bağlı bir floresan prob akuple doğruladı. Ligand bağlanması, tüm hücre yüzeyinde (Şekil 4) oluşur. Cilt siteleri axostyle (mikrotübül bir levha) ve P. içinde çekirdeği üzerinde protozoa ön bölgede yoğunlaşmıştır. grassii.

Biz protozoa yutulur ahşap parçacıkların bazı yamalı otofloresans gözlemledi. Ancak yüzey axostyle ve çekirdeği (Şekil 4) hiçbir otofloresans olmadığından, otoflöresans, genellikle belirli bağlayıcı ligand ayırt etmek kolaydır.

Ayrıca ligand protozoa için genel yapıları bağlar önerir test edilen tüm serbest yaşayan aerobik protozoa türleri (Şekil 5), floresan algıladı. Ancak, ligand bağlanması E. gözlendi coli.

Deney 3: Bir mcM ligand litik peptid Formosan yeraltı termit işçilerin bağırsak ve serbest yaşayan T. protozoa üç tür öldürdü 10 dakika daha az in vitro pyriformis kontrolleri hayatta kalırken . Şekil 6 ligand-litik peptid ile tedavi protozoa termit gut membran bütünlüğünün ilerici kaybı gösterir. Membranlar çıkıntı ve rüptürü, protozoa büzüşmeli ve ölürler. E. sayı fark yok gözlendi ligand-litik peptid ve su tedaviler arasında coli kolonileri. Ancak, hiçbir ligand Parçalayıcı peptid E. sayısını azalttı oldukça coli kolonileri (Şekil 7). Bu, bir dereceye kadar ligand bu eki lizis olmayan hedef mikroorganizmaların korur göstermektedir.

Deney 4: floresan işaretli ligand 0.3 ul 50 mcM termit işçilerin hindgut enjekte edildi P. bağlanarak grassii, S. leidyi ve H. hartmanni Uzm benzer floresan mikroskopi ile teyit edilmiştir. 2 (Şekil 4). Termit bağırsak dokusu floresan göstermemiştir.

Deney 5: 0.3 ul 500 mcM ligand-litik peptid enjeksiyon Formosan yeraltı termitler bağırsak protozoa 24 saat içinde üç tür öldürdü. Termitler, simbiyotik protozoa kaybı sonra 10 gün içinde öldü. Daha önce, Husseneder ve Collier (2009), litik peptid aynı konsantrasyonu termit cesaret içine enjekte edilir. Bağırsak (72 saat) tek hücreli canlılar ve termitler (altı hafta) ölmüş kadar ekli ligand olmadan, daha fazla zaman aldı. Bu ligand litik peptidler, protozoa parçalayıcı peptidler bağlanarak büyük olasılıkla protozoacidal verimliliği artırdığını göstermektedir.

Şekil 1. : bağırsak ana bölümden (ön, orta, hindgut) gösteren bir slayt Formosan yeraltı termit gut, b 1 ve 2: Hindgut protozoa içeren bağırsak içeriği çıkarmak için forseps ile deldi.

Şekil 2. Formosan yeraltı termit hindgut bulundu protozoa flagellate üç türleri: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, ve c) Spirotrichonympha leidyi.

Şekil 3. A) Sağlıklı kültür protozoa, b), şişkin membranlara Protozoa, c) protozoa protozoa azalıyordu.

Şekil 4. Ligand bağlama Onay gut termitlerin bir floresan bir prob ile birleştiğindefloresan işaretli ligand ve tedavi edilmezse denetimleri (otofloresans gösteren) ile tedavi: (P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi yukarıdan aşağıya doğru) protozoa.

Şekil 5. Ligand bağlayıcı ve serbest yaşayan aerobik, a) Tetrahymena, b) amip, c) Euglena protozoa ve d) Paramecium .

Şekil 6. A) su (kontrol) ve b) 1 mcM ligand-litik peptid protozoa tedavisi.

Şekil 7 E. plakalar üzerinde coli kolonileri (10 ^-4 dilüsyon):)) su (kontrol), b Tedavi 1 mcM ligand litik peptid, c ile Tedavi) 1 mcM parçalayıcı peptid ile Tedavi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

(Hansel ve Leuschner 2004, Hansel ve ark 2007) kanser hücrelerinin etkin bir şekilde hedef ve yok etmek için ligand-litik peptidler başarıyla kullanılmaktadır. Bu kavram üzerine kuruludur, biz yüzeyine bağlanan heptapeptide ligand geliştirdi Formosan yeraltı termitler bağırsak protozoa ve bu, termit ulaşmak için, termitler, bağırsak bu zorunlu selüloz sindiren symbionts yok etmek amacı ile bir litik peptide birleştiğinde kontrol (Husseneder ve Collier 2009).

Bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Anaerobic glove box	Coy Laboratories, Inc.	Custom made
Intellus environmental controller	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 Glass micropipette puller	Narishige International	PC-10
Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Leitz micromanipulators	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Microinjector	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA fluorescence imaging system	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA dissecting scope	Leica Microsystems	MZ16
LEICA microscope	Leica Microsystems	DMLB
Olympus dissecting scope	Olympus Corporation	SZ61