원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection)

요약

우리는 리간드가 원생 ​​동물문 lytic 펩티드와 결합하여 형광 현미경 그 리간드를 사용하여 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문 죽이는 셀룰로오스 - 소화 이들의 표면 막에 바인딩 입증 절차를 제시 체외에서 (무산소 원생 동물문 문화)와 생체내에 (흰개미의 hindgut로 주입).

초록

우리는 화학 살충제의 사용에 대한 신뢰 감소로 이어질 것이 지하 흰개미 컨트롤에 소설 접근법을 개발하고 있습니다. 지하 흰개미는 나무를 효율적으로 소화하기 위해 노동자의 hindguts의 원생 동물문에 의존하고 있습니다. Lytic 펩티드는 protozoan 기생충 (Mutwiri 외. 2000) 다양한 죽일 표시되며 또한 Formosan 지하 흰개미, Coptotermes formosanus (Husseneder 및 콜리어 2009)의 용기 원생 동물문되었습니다. Lytic 펩티드는 eukaryotes의 특이 현상이 면역 체계의 일부이며, 미생물 (Leuschner 및 헨젤 2004)의 세포막을 파괴. 그들은 높은 eukaryotes (Javadpour 외. 1996)의 전기 중립 콜레스테롤 함유 세포 세포막에 영향을주지 않기 때문에 대부분의 lytic 펩티드는 높은 eukaryotes을 해칠 가능성이 없습니다. Lytic 펩타이드 작업은 리간드의 추가에 의해 특정 세포 유형에 타겟팅할 수 있습니다. 예를 들어, 헨젤 외. (2007) lytic 펩티드 혼자가 아닌 특정 펩티드와 복합가 효과적이지 않을 동안 암 세포막 수용체 리간드와 복합 lytic 펩티드는, 유방암 세포를 파괴하는 데 사용될 수 있다고 보도했다. Lytic 펩티드는 또한 전립선과 고환의 암 세포 (Leuschner 및 헨젤 2004)의 타겟 파괴에 대한 종양 세포의 수용체에 바인딩 인간 호르몬으로 복합되어있다.

이 문서에서 우리는 Formosan 지하 흰개미의 내장에서 원생 동물문의 표면 막에 바인딩 heptapeptide 리간드에 결합 lytic 펩타이드 (헤케이트)의 protozoacidal 활동을 설명하는 데 사용되는 기법을 제시한다. 이러한 기법은 흰개미 노동자의 창자의 근절을 포함, 창자의 무산소 문화 (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, 원생 ​​동물문
Spirotrichonympha leidyi), 형광 염료로 표시된 리간드가 원생 동물문하고 있지만 세균이나 직감 조직에 원생 동물문 자유 사는 다른 흰개미 굿에 바인딩되는 미세한 확인. 우리는 또한 lytic 펩타이드에 결합 같은 리간드 효율적으로 체외 (원생 동물문 문화) 및 생체내 (근로자의 hindgut에 microinjection)의 원생 동물문 흰개미 굿을 죽이고 있지만, 혼자 lytic 펩타이드보다 bacteriacidal는 것을 보여줍니다. 미만 2 주 이내에 흰개미의 죽음에 원생 동물문 연결의 손실.

앞으로, 우리는 유전 흰개미 창자에서 원생 동물문을 죽이고 이후 식민지에서 흰개미를 죽이겠어요 리간드 - lytic 펩티드를 표현하는 "트로이 목마"로 흰개미 식민지를 통해 흰개미의 hindgut 및 확산에 살아남을 수 미생물 엔지니어 것입니다 . 리간드 - lytic 펩티드는 또한 protozoan의 기생충에 대한 약물 개발을위한 유용하게 사용될 수 있습니다.

프로토콜

실험 1 : 흰개미 굿의 추출은 혐기성 조건 하에서 원생 동물문

1. 지속적으로 습도 및 산소 레벨을 제어하고 고르지 온도를 제거하기 위해 건조 및 종류 D 촉매가 Stak - 팍스를 통해 공기를 순환하는 글러브 박스에 팬 상자 (코이 연구소)를 사용하십시오. 20-30 분 질소의 지속적인 흐름으로 장갑 상자를 채웁니다. 1 H.위한 산소 센서 (C - 제곱 (주))와 산소 수준을 모니터링 필요할 경우 혐기성 조건을 달성하고 유지하기 위해 질소를 사용합니다.
2. 트레거 U 미디어 (트레거 1934)을 준비하고 7.0 산도를 조정합니다. 2.5 % 수소, 5 % 이산화탄소와 산소의 잔류물을 제거하는 1 H에 대해 92.5 %의 질소의 혼합물로 장갑 상자에서 필터 살균 미디어를 뿌리다.
3. 의 흡착을 방지하기 위해 Sigmacote를 사용하여 실험에 사용되는 현미경 슬라이드, microcentrifuge 튜브, pipettes, 유리 등 모든 자료를 Silanize 원생 동물문 또는 표면에 펩티드 (Sigmacote, 시그마, # SL - 2, http://www.sigmaaldrich.com/ 등 / medialib / 워드 프로세서 / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. 원생 동물문 흰개미 굿은 엄격하게 혐기성 생물이기 때문에 그들은 산소에 노출되어서는 안됩니다. 따라서 다음 단계는 글러브 박스 (1.1 참조)에서 혐기성 조건 하에서 수행됩니다. 포셉 잠수함 70 %의 에탄올과 약 10 s에 대한 부드럽게 소용돌이 표면 오염 물질을 제거에 흰개미 노동자의 전신으로.
5. 에탄올에서 노동자를 제거하고 약 20 S.위한 깨끗한 Kimwipe에 건조 수 작업자 복부를 잡고 부드럽게 45도 각도 위쪽으로 또는 아래쪽으로 창자를 당길 포셉 또 한 쌍의와 복부의 팁을 잡기 위해 멸균 미세 밀고 집게를 사용하십시오. 창자가 직선 각도로 너무 많은 힘을 함께 가져온 경우 따로 깰 가능성이 높습니다. 현미경 슬라이드에 100 μl 트레거 U 미디어의 드롭 10 용기를 배치합니다.
6. 피어스 릴리스 살균 훌륭한 해부 프로브 한 쌍의와 내장 원생 동물문 부드럽게 900 μl 트레거 U 미디어를 포함하는 1 ML의 microcentrifuge 관에 200 μl 피펫과 직감의 내용을 전송할 수 있습니다. 직감 벽 조각 (5 S), 새로운 튜브에 뜨는의 양도 900 μl의 침강에 대한 허용 후.
7. sigmacoted 현미경 슬라이드에 원생 동물문 문화 10 μl를 전송 200 X의 배율의 현미경으로 원생 동물문의 상태를 확인하십시오.
8. 에어로빅 원생 동물문 Tetrahymena의 pyriformis, 아모 이바 SP., Euglena SP. 그리고 Paramecium SP의 관리 문화를 준비합니다. (캐롤라이나 생물학 공급 회사, 벌링턴, NC)뿐만 아니라 공급 업체에서 권장하는 문화 미디어에서 대장균의 하룻밤 문화 등.

실험 2 :에 형광 염료와 결합 리간드 추가 원생 ​​동물문과 박테리아 문화는 표면 세포막과 세포 벽에 바인딩을위한 테스트

우리는 이전에 (http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf보실 수 있습니다 프로토콜) 원생 동물문에 바인딩 19 heptapeptide 시퀀스를 식별하는 파지 디스플레이 라이브러리 (뉴 잉글랜드 Biolabs 부동산, 입스 위치, MA)를 사용합니다. Trypanosoma brucei 막에서 알려진 putative glycoproteins에 유사 보여 펩티드 순서 (ALNLTLH)와 리간드가 합성 및 C - 터미널 형광 프로브 (EDANS, 5 결합했다 - ((2 - Aminoethyl) 아미노) 나프탈렌 - 1 - sulfonic EDANS NovaTag 수지 (EMD Biosciences)를 사용하여 고체 펩타이드 합성 (SSPS)를 통해 산, λmax = 341 nm의, λem = 471 NM). 여기서 우리는 리간드는 흰개미 창자와 원생 동물문 무료 생활의 다른 아니지만 세균에 격리 있다고 원생 동물문에 바인딩 것을 보여줍니다.

1. 문화로 특급에서 설명하는 원생 동물문. 1. 12 H. 4 10 %의 포름 알데히드 ° C와 원생 동물문 수정
2. 원생 동물문 솔루션 (30 XG, 10 분)을 원심 분리기, 표면에 뜨는를 버리고 고정 1ml 트레거 U 미디어 두번 원생 동물문을 포함한 펠렛 씻으십시오. 펠렛은 1 ML 트레거 U 미디어 다시 일시 중지합니다. 또한, 원생 동물문 기타 수정하고, E. 컨트롤 대장균 박테리아.
3. 50 μm의의 최종 농도에 형광 염료 EDANS (물 준비)을 결합하여 합성 리간드의 솔루션으로 1-2 H에 대한 고정 미생물을 품어. 리간드는 트레거 U 미디어보다 물 속에서 더 사라져 버린다고합니다.
4. 341 nm의 흡광도에서 최대 및 471 nm의 청색에서 지역의 배출량 400 X의 배율에서 형광 현미경으로 미생물을 관찰.

실험 3 : 체외에서 lytic 펩타이드 (원생 동물문 문화)에 결합 리간드의 protozoacidal 활동을 테스트

리간드의 공액 및 lytic 펩타이드 헤케이트는 (Mutwiri 외. 2000) 이전에 LSU 단백질 시설에서 합성되었다.

1. 자료를 Silanize과 무산소 글러브 박스에 흰개미 굿 원생 동물문 문화를 준비S는 특급으로 설명했다. 1.
2. aerobe 제어 미생물 (예를 들어, E. 대장균과 자유 생활 원생 동물문 종 티 pyriformis)의 문화를 준비합니다.
3. 글러브 박스, 0.5 ML Eppendorf 튜브에 원생 동물문 문화의 198 μl의 피펫 6 aliquots의 혐기성 환경에서. 흰개미 창자 원생 동물문 문화의 aliquots의 절반 (최종 농도 1 μm의)에 리간드 - lytic 펩타이드의 100 μm의 솔루션 2 μl를 추가합니다. aliquots의 다른 절반 (컨트롤)에 물 2 μl를 추가합니다.
4. benchtop에서 E. 비슷한 aliquots 준비 대장균과 T. 1 μm의 lytic 펩타이드, 리간드 - lytic 펩타이드 또는 물로 pyriformis.
5. 1 H 후, 슬라이드 각 원생 동물문 문화 10 μl를 전송합니다. 200 X의 배율의 현미경으로 컨트롤의에 원생 동물문 처리의 생존을 비교합니다.
6. 1 일 이후 H, 약 플레이트 100 μl. E. 10 ^-4 희석 ° C 야간 37 BHI과 부화에 대장균 문화. 접시에 콜로니 형성 단위의 숫자를 비교합니다.

실험 4 : 흰개미 hindgut에의 형광 염색에 결합 리간드의 분사

1. 20-30 μm의의 팁 크기를 얻기 위해 듀얼 스테이지 열 수준 (65 48)와 Narishige PC - 10 유리 micropipette의 풀러를 사용하는 바늘 (모델 GD - 1, 1 X 900mm) 당기세요. 마이크로 미터를 사용하여 현미경으로 그것을 측정하여 팁 크기를 확인합니다.
2. CA 한 바늘을 입력합니다. 찬란 표시 리간드의 50 μm의 30 μl가 연결된 주사기를 사용하여 물속에서 정지. 제어를위한 물을 다른 바늘을 입력합니다. micromanipulator의 홀더에 micropipette (0.5 μl 용량과 32mm의 길이, 드루먼드 과학 회사)를 연결합니다. 두 번째 micromanipulator에 분사 시스템 홀더에 바늘을 연결합니다. 약 1 S 펄스 길이와 10-12 PSI 주입으로 초기 주입 매개 변수를 설정합니다. micropipette로 천천히 주사를 미리하고 일정한 볼륨 reproducibly 주입되도록 제어 질소 가스 흐름에 연결된 펄스 길이 컨트롤 페달 구동 고속 전자 분사 시스템을 사용하여 솔루션을 주입. 주사 후, micropipette를 제거하고 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주입 용액의 길이를 기록합니다. micropipette의 알려진 매개 변수에서 주입된 볼륨을 계산합니다. 질소 가스와 단일 주사에 0.3 μl 솔루션을 추방하기 위해 펄스 길이의 압력을 조정합니다.
3. 항문에 배설물 선물을 제거하는 소프트 포셉있는 흰개미 노동자의 복부의 끝에 머리를 묶어라. 5 분 얼음 그들을 재미로 흰개미 노동자를 무력화.
4. 메스 블레이드를 사용하여 100 μl 피펫 팁을 절단하여 흰개미 노동자를 보유하는 수신기를 확인합니다. 10 길이 끝을 잘라 - 12mm과 흰개미의 크기에 따라 사용합니다.
5. micromanipulator에 리시버를 연결합니다. 는 등의 측면에 페트리 접시에 노동자를 삽입하고 질소 흡입 펌프를 사용하여 수신기에 먼저 작업자 머리를 대기음 수 있도록 수신기에서 작업자 protrudes의 종착역.
6. 수신기에있는 흰개미를 들고 조심스럽게 노동자 항문에 삽입하는 micromanipulator를 사용하여 채워진 바늘을 미리. 솔루션의 0.3 μl를 (컨트롤 찬란 표시 리간드 또는 물) 주입.
7. 젖은 종이 필터와 함께 별도의 배양 접시에 리간드 또는 물을 주입 노동자를 놓고, 26에서 그들을 유지 ± 2 ° C와 78% RH
8. 주입 흰개미의 내장을 근절하다하고 수집 위의 특급 같이 24 H 후 원생 동물문. 1. 수정과 같은 특급과 같이 원생 동물문 관찰합니다. 2.

실험 5 : 생체내에 lytic 펩타이드 (흰개미 hindgut에 주입)에 결합 리간드의 protozoacidal 활동을 테스트

1. 특급에서 설명한대로 자료를 Silanize. 1.
2. 물속에 리간드 - lytic 펩타이드의 500 μm의 솔루션을 준비합니다.
3. 유리 바늘, 수신기 및 흰개미 노동자를 준비 3.4) 단계 3.1) 따르십시오.
4. 3.5에서 설명한 방법) 20 흰개미 노동자의 hindgut에 리간드 - lytic 펩타이드 솔루션 (치료) 나 물 (제어)의 0.3 μl를 주입 다음.
5. 여러 노동자 24 H에 대한 흰개미, 절멸하다 용기를 잡고 3.6에서 설명한대로) 현미경 굿 내용을 관찰합니다. 및 3.7).
6. 흰개미 굿의 원생 동물문의 죽음이 확인 즉시, 촉촉한 필터 종이 배양 접시에 남아있는 치료 흰개미와 컨트롤을 유지하고 일상적인 사망률을 관찰.

대표 결과 :

실험 1 : 보통, foregut, midgut 및 hindgut이 절차는 (그림 1A) 제대로 따라하면 한 조각에서 얻을 수 있습니다. hindgut의 무산소 부분에 고밀도에있는 원생 동물문 및 포셉 (그림 1B 1 & 2)로 hindgut을 천공하여 발표하실 수 있습니다. 최대 킬로그램Formosan 지하 흰개미의 용기 재미 시온단 종은 스핀들 모양의 P.입니다 200-300 μm의 길이 150 μm의 폭이고 육안으로 볼 수 grassii. 두 번째로 큰 종족은 배 모양의 H.입니다 hartmanni (50-140 μm의 길이 30-80 μm의 폭). 가장 작은 종족은 원추 모양의 S.입니다 leidyi (15-50 μm의 길이 8-30 μm의 다양한;. 라이 외 1983). 원생 동물문 종 그림 2에 표시됩니다.

최적의 문화 환경에서 Formosan 지하 흰개미의 내장에서 격리 원생 동물문의 세 종류가 무산소 트레거 U 미디어 (그림 3A)에 적어도 72 H에 대한 살아 있고 건강을 유지합니다. 그러나, 문화 조건이 최적이되지 않은 경우 원생 동물문 빨리 죽을 것이다. 미디어 산소 잔류물이있다면, 원생 동물문의 움직임은 즉시 중단됩니다. 삼투압은 무결성이 밖으로 원생 동물문 윌 솟아오른 곳과 전지의 파열 (그림 3B)의 표면 막에 손상 너무 높거나 멤브레인 경우. 삼투압가 너무 낮거나 세포막을 손상하는 경우에는 원생 동물문 (그림 3C) 주름 및 축소합니다.

실험 2 : 우리는 리간드가 감지 밀도에 Formosan 지하 흰개미의 hindgut에서 원생 동물문의 세 종류로 바운드 형광 프로브에 결합 것으로 확인되었습니다. 리간드 바인딩은 전체 세포의 표면 (그림 4)에서 발생합니다. 바인딩 사이트 axostyle (microtubules의 시트)와 P.의 핵에있는 원생 동물문의 앞쪽에 지역에 집중되어있다 grassii.

우리는 원생 동물문에 의해 섭취 목재 입자의 일부 누덕누덕 기운 autofluorescence을 관찰했다. 표면, axostyle과 핵 (그림 4)에 대한 autofluorescence가 없기 때문에 그러나, autofluorescence는 보통 리간드의 특정 바인딩에서 분별하기 쉽습니다.

우리는 또한 리간드가 원생 ​​동물문에 일반적인 구조에 바인딩하는 것이 좋습니다 모든 테스트를 무료 생활 에어로빅 원생 동물문 종 (그림 5)에서 형광을 감지. 그러나, 리간드 바인딩은 E.에 대한 관찰 않았다 대장균.

실험 3 : 리간드 - lytic 펩타이드 중 하나 μm의는 Formosan 지하 흰개미의 근로자의 창자와 자유 생활 T.에서 원생 동물문의 세 종류를 죽였어 미만 10 분 안에 체외에서 pyriformis, 컨트롤이 살아 남아있는 동안. 그림 6은 리간드 - lytic 펩타이드 대우 원생 동물문 흰개미 굿의 막 무결성의 진보 손실을 보여줍니다. 세포막의 팽창과 파열, 원생 동물문 주름, 죽습니다. 아무 차이는 E.의 숫자에서 관찰되지 않았습니다 리간드 - lytic 펩타이드와 물 사이의 트리 트먼트 대장균 식민지. 노 리간드와 Lytic 펩타이드 그러나, E.의 수를 줄일 상당히 콜리 식민지 (그림 7). 이것은 어느 정도로 리간드의 첨부 파일이 용해 이외의 대상 미생물을 보호하는 것이 좋습니다.

실험 4 : 찬란 표시 리간드의 0.3 μl 50 μm의이 흰개미 노동자의 hindgut에 주입했다, P.에 바인딩 grassii, S. leidyi 및 H. hartmanni는 특급과 비슷한 형광 현미경을 통해 확인되었다. 2 (그림 4). 흰개미 굿 조직 형광 표시하지 않았다.

실험 5 : 0.3 μl 500 μm의 리간드 - lytic 펩타이드의 주입은 24 시간 이내 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문의 세 종류를 죽였어. 흰개미는 공생 원생 동물문의 손실 후 10 일 이내에 사망했다. 이전 Husseneder 및 콜리어 (2009) 흰개미 창자로 lytic 펩타이드의 동일한 농도를 주입했다. 창자 (72 H)의 원생 동물문과 흰개미는 (6 주) 죽은 줄 때까지 첨부된 리간드없이, 그것은 더 많은 시간이 걸렸습니다. 이것은 리간드가 원생 ​​동물문에 lytic 펩티드를 결합하여 대부분 lytic 펩티드의 protozoacidal 효율성을 증가시킬 수있다는 것을 제안합니다.

그림 1. A : 창자의 주요 부분 (포어 -, 중반, hindgut)를 보여주는 슬라이드에 Formosan 지하 흰개미 굿, B 1 & 2 : Hindgut은 원생 동물문 들어있는 용기를 내용을 공개 포셉와 피어싱입니다.

그림 2. Formosan 지하 흰개미의 hindgut에서 발견 원생 동물문 채찍질의 세 종류 : A) Pseudotrichonympha grassii, B) Holomastigotoides hartmanni, 및 C) Spirotrichonympha leidyi.

그림 3. 문화 원생 동물문,) 건강한는 b)를, 불룩한 세포막과 원생 동물문, C)를 원생 동물문 원생 동물문 줄어들.

그림 4. 리간드의 바인딩의 확인서 직감을 흰개미에 형광 프로브에 결합, 찬란 표시 리간드 및 치료 컨트롤 (autofluorescence를 보여주는)와 처리 (P. grassii, H. hartmanni, S. leydi 위로부터 아래로) 원생 동물문.

그림 5. 리간드는 무료 생활 바인딩 에어로빅,) Tetrahymena, B) 아모 이바, C) Euglena에게 원생 동물문, 그리고 D) Paramecium.

그림 6. A) 물 (제어) 및 B) 1 μm의 리간드 - lytic 펩타이드와 원생 동물문의 치료.

그림 7. E. 접시에 콜리 식민지 (10 ^-4 희석) :)) 물 (제어), B로 치료 1 μm의 리간드 - lytic 펩타이드, C로 치료) 1 μm의 lytic 펩타이드로 치료.

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토론

리간드 - lytic 펩티드가 성공적으로 효과적으로 암 세포를 (헨젤과 Leuschner 2004, 헨젤 외. 2007) 목표 및 파괴하는 데 사용되었습니다. 이런 개념을 바탕으로, 우리는 표면에 바인딩 heptapeptide 리간드를 개발 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문와 흰개미를 달성하는 흰개미의 창자에 이러한 의무 셀룰로오스 - 소화 symbionts를 파괴할 목적으로 lytic 펩타이드에 결합 제어 (Husseneder 및 콜리 2009). ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Anaerobic glove box	Coy Laboratories, Inc.	Custom made
Intellus environmental controller	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 Glass micropipette puller	Narishige International	PC-10
Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Leitz micromanipulators	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Microinjector	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA fluorescence imaging system	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA dissecting scope	Leica Microsystems	MZ16
LEICA microscope	Leica Microsystems	DMLB
Olympus dissecting scope	Olympus Corporation	SZ61