Ex vivo-Kultur der Patient Tissue & Prüfung von Gentransfer

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Kultur der Patientensicherheit Gewebeschnitten für den Gentransfer-Studien und die anschließende Analyse der Genexpression mittels IVIS Biolumineszenz-Bildgebung.

Zusammenfassung

Dieses Video beschreibt die Verwendung von Gewebe des Patienten als ex vivo-Modell für die Untersuchung der Gene Delivery. Frisches Gewebe des Patienten zum Zeitpunkt der Operation gewonnen wird in Scheiben geschnitten und in Kultur gehalten. Die ex vivo-Modell-System ermöglicht die physische Lieferung von Genen in intakte Gewebe des Patienten und die Genexpression durch Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Detection System analysiert. Die Biolumineszenz Detection System zeigt eine schnelle und genaue Quantifizierung der Genexpression in einzelne Segmente, ohne dass Gewebe zu opfern. Diese Scheibe Gewebekultur-System kann in einer Vielzahl von Gewebetypen einschließlich der normalen und malignen Gewebe verwendet werden und ermöglicht es uns, die Auswirkungen der heterogenen Natur der intakten Gewebes und der hohe Grad an Variabilität zwischen den einzelnen Patienten zu untersuchen. Dieses Modell System könnte in bestimmten Situationen als Alternative zu Tierversuchen und als ergänzende präklinische Modus vor dem Eintritt in klinische Studie verwendet werden.

Protokoll

Vorbereitung der Medien und Reagenzien

1. Antibiotika-Lösung
   Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 200 U / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Fungizone
2. Sammlung und Behandlung Medium
   Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 200 U / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin, 5 ug / ml Fungizone
3. Nährboden
   Sammlung Medium mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Rinderserum

I. Tissue Datenerhebung und-speicherung

Zulassung für Patienten Gewebe Sammlung wurde von der Clinical Research Ethics Committee der Cork Teaching Hospitals erhalten und Einwilligung wurde von den Patienten am Tag vor der Operation erhalten. Lebergewebe wurde von Patienten, bei denen eine partielle Hepatektomie für bösartige Erkrankung erhalten.

1. Frisches Gewebe des Patienten zum Zeitpunkt der chirurgischen Resektion erhalten.
2. Das Gewebe wird in der Sammlung Medien Lagerung bei 4 ° C (Tissue gespeichert werden können gekühlt bis zu 12 h ohne nennenswerten Verlust der Lebensfähigkeit, aber sofortige Verarbeitung wird empfohlen).

II. Gewebeschnitt Vorbereitung und Kultur

Slicing wurde mit einem Vibratom (Leica, Deutschland). Das Gewebe schneiden System wurde nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Gewebeschnitt Präparat wurde unter einer sterilen Haube mit Instrumenten mit 70% 2-Propanol gereinigt durchgeführt. Schichtdicke ist bei 2000 Mikrometer eingestellt und schneiden mit einer Hin-Klinge bei 22-26 Umdrehungen pro Minute.

1. Das Gewebe wird in Antibiotika-Lösung dreimal gewaschen.
2. Das Gewebe wird zur Montage der Bühne mit ungiftigen Kleber (Dermabond) befestigt.
3. Schichtdicke eingestellt ist und das Schneiden ist bei 22-26 Umdrehungen pro Minute erreicht.
4. Scheiben sind in Kulturmedium in 6-well Kulturschalen (eine Scheibe pro Well) bei 37 ° C mit 5% CO ₂ in eine feuchte Umgebung.

III. Gene Lieferung an Gewebeschnitten

1. Scheiben werden bei 37 vorinkubiert ° C für 2 h vor der Behandlung.
2. Kulturmedium wird mit der Behandlung Medium ersetzt.
3. Slices sind direkt mit viralen Vektor (25 ul von Viruspartikeln Ad5.CMVluc [1x10 ^9]). Injiziert Alternativ können Partikel, die zugesetzt werden, für passive Infusion.
4. Nach zwei Stunden Inkubation wird Serum zugesetzt.

IV. Die Analyse der Genexpression durch Biolumineszenz-Analyse

1. Scheiben sind mit 100 ul Luciferin-Substrat (3 mg / ml) injiziert.
2. 6-well Kulturschale auf der Bühne platziert und für 10 min inkubiert.
3. Scheiben sind für 5 min bei hoher Empfindlichkeit (Abbildung 1) abgebildet.

V. repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Bioluminescent Bildgebung von Patienten mit Leber-Scheiben IVIS Detection System.

Diskussion

Wir beschreiben eine ex vivo Patienten Gewebekultur-Methode und Biolumineszenz Detection System für die Beurteilung der Gen-Lieferung innerhalb von nicht fixierten menschlichen Gewebe. Das Verfahren bietet eine einfache und reproduzierbare Weise der Kultivierung Gewebeschnitten. Es hat ein erhebliches Potenzial, wie es das Studium der Gentransfer in intakte menschliche Gewebe, die Analyse der Gene Delivery ermöglicht in einer Vielzahl von menschlichem Gewebe einschließlich bösartiger Gewebe und können wich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc
Dermabond	Johnson & Johnson
Vibrotome	Leica Microsystems	VT 1000 A