Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren bietet ein Mittel, um ihren Nutzen als Zell-Transplantationen für therapeutische Zwecke zu untersuchen sowie viele grundlegende Prozesse des menschlichen neuronalen Entwicklung und Pathologie zu erkunden. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, die Standardisierung dieser Technik und die Reproduzierbarkeit erhöht der Forschung mit menschlichen Stammzellen. Die hNSPCs wir wurden von Leichen postnatalen Gehirn Kortex durch die National Human Neural Stem Cell Ressourcen isoliert und gezüchtet als adhärente Kulturen auf Flaschen mit Fibronektin (Palmer et al, 2001..; Schwartz et al, 2003) beschichtet. Wir Kultur unserer hNSPCs in DMEM: F12 serum-freien Medien mit EGF, FGF und PDGF ergänzt und Passage ihnen 01.02 etwa alle 7 Tage. Mit diesen Bedingungen halten die Mehrheit der Zellen in der Kultur eine bipolare Morphologie und auszudrücken Marker für undifferenzierte neurale Stammzellen (wie Nestin und Sox2).

Protokoll

Hinweis: Für die routinemäßige Kultivierung unserer hNSPCs, ändern wir 50-100% der Medien jeden zweiten Tag und in der Regel Durchgang ihnen 01.02 einmal pro Woche. Die Kulturmedien enthält 20% BIT-9500, 1X Antibiotikum / Antimykotikum, und Wachstumsfaktoren (EGF, FGF und PDGF jeweils bei 40 ng / ml) in DMEM: F12 Basis-Medien.

Vorbereiten des Coated Flask und Dissoziation der Zellen

1. Um neue Flaschen für die passagiert Zellen, Mantel T25-Kolben mit 10 pg / ml humanem Fibronectin in EMEM für 4 Stunden oder über Nacht in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator vorzubereiten. Kurz vor Passage der Zellen, entfernen Sie die Fibronektin-Lösung und spülen Sie die Flaschen mit PBS.
2. Übertragen Sie die alte "konditioniert" Medien aus den Zellen an die neuen Fibronektin-beschichteten Kolben (so dass die Hälfte der Endvolumen von Medien für jede Flasche die "konditioniert" Medien) passagiert werden. Diese Kultivierungsbedingungen helfen diese Zellen im undifferenzierten Zustand.
3. Sobald alle Medien aus den Zellen zu passagiert werden entfernt ist, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Achten Sie darauf, nicht austrocknen der Zellen.
4. Add Zelldissoziation Buffer (CDB) direkt auf die Zellen (1,0-1,5 ml für eine T25 Flasche). Inkubieren Zellen in den Puffer für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur. Leichtes Antippen der Flasche wird zur Beschleunigung Zellablösung.

Zentrifugieren, Resuspendieren und Plating Cells

1. Add serumhaltigem Medium (DMEM: F12 mit 10% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum) (Einsatz ~ 3X das Volumen der CDB) in den Kolben mit abgelösten Zellen. Entfernen Sie die Medien und die Zellen in ein 15 ml konischen Rohr. Mit einem kleinen Volumen von frischem Serum-haltigen Medien in den Kolben gespült und wieder Residualzellen.
2. Centrifuge die Medien und die Zellen bei 1000 rpm (~ 200xg) für 5 Minuten.
3. Absaugen des Serum-haltigen Medien und Zellen in frischem Kulturmedium, und Abpipettieren eine homogene Zellsuspension zu machen.
4. Übertragung der Hälfte der resuspendierten Zellen in jede neue Flasche für einen 1:2 aufgeteilt. Beachten Sie die neue Passage-Nummer auf der Flasche.

Diskussion

Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll zuverlässig Kulturen hNSPCs bietet. Ein kritischer Faktor für unsere Zellen ist, dass sie als ziemlich dichte Kulturen gehalten werden und kann nicht bis zu dem Punkt, dass die Zellen spärlich sind passagiert werden müssen. In unseren Händen, wachsen spärlich Kulturen nur sehr langsam oder endgültig einzustellen Division. Aus diesem Grund haben wir in der Regel aufgeteilt unseren Kulturen 1:2 oder 1:3, wenn eine Kultur ist extrem dicht. Die Beschichtung der Oberfläche einer Kulturschale ...

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)	Reagent	Stem Cell Technologies	09500
Antibiotic-Antimycotic	Reagent	Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagent	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum	Reagent	Invitrogen	10437-028
FGF, human basic recombinant	Reagent	Peprotech	100-18B
PDGF-AB	Reagent	Peprotech	100-00AB
EGF, human recombinant	Reagent	BD Biosciences	CB40052	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural	Reagent	BD Biosciences	CB40008A	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Cell Dissociation Buffer	Reagent	Invitrogen	13150-016